3D體外雙相軟骨-骨構(gòu)建物發(fā)明背景多種疾病與關(guān)節(jié)軟骨的退行性變化或骨髓中的誤導(dǎo)(misguided)分化過(guò)程有關(guān)。肌肉-骨骼系統(tǒng)的疾病代表德國(guó)疾病治療中繼心血管系統(tǒng)疾病和消化系統(tǒng)疾病之后的第三大高成本集中因素。成功治療這種疾病的一個(gè)先決條件是了解骨髓中造成這些疾病或與其有關(guān)的細(xì)胞過(guò)程。因此，通過(guò)置換患者的造血系統(tǒng)來(lái)治療例如白血病是可能的。但是，還有自身免疫性疾病，如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎或紅斑狼瘡，也被長(zhǎng)壽命的血漿和居于骨髓特化生態(tài)位的記憶T細(xì)胞調(diào)節(jié)。骨髓是多功能的多細(xì)胞組織，其與其他物質(zhì)位于長(zhǎng)骨腔中。在軟骨內(nèi)骨化的背景下——長(zhǎng)骨發(fā)育，在第4個(gè)月左右胚胎發(fā)育期間，組織發(fā)育。骨髓的特征在于多孔結(jié)構(gòu)，其由松質(zhì)骨和充滿大量薄壁血管的特化結(jié)締組織——骨髓竇狀隙——形成。骨髓的主要功能之一是為造血系統(tǒng)中造血細(xì)胞分化提供適當(dāng)?shù)沫h(huán)境。造血干細(xì)胞(HSC)代表這些分化過(guò)程的起點(diǎn)，其中造血干細(xì)胞以未分化的狀態(tài)居于骨髓松質(zhì)骨結(jié)構(gòu)的造血干細(xì)胞生態(tài)位中。造血干細(xì)胞生態(tài)位被分成兩種功能不同的亞型。在成骨細(xì)胞-生態(tài)位中，造血HSCs通過(guò)不同的附著和信號(hào)傳導(dǎo)分子與特化成骨細(xì)胞相互作用，從而使HSCs保持處于圓形非增殖狀態(tài)。在發(fā)動(dòng)HSCs后，干細(xì)胞遷移至位于竇狀隙的血管干細(xì)胞生態(tài)位，在此HSCs呈現(xiàn)增殖增加。根據(jù)當(dāng)今對(duì)骨髓中的造血干細(xì)胞生態(tài)位的理解，干細(xì)胞生態(tài)位系統(tǒng)的最小單位由成骨細(xì)胞生態(tài)位和位于松質(zhì)骨竇狀隙血管的血管生態(tài)位的組合形成。除干細(xì)胞生態(tài)位的功能結(jié)構(gòu)外，當(dāng)前的研究公開(kāi)了骨髓作為免疫學(xué)記憶的來(lái)源。間充質(zhì)基質(zhì)細(xì)胞(MSC)充當(dāng)血漿和記憶T細(xì)胞的存活生態(tài)位的細(xì)胞構(gòu)建件?？傊?，骨髓的生物學(xué)功能性取決于多種細(xì)胞，如HSC、MSC、內(nèi)皮細(xì)胞和成骨細(xì)胞，及其在空間隔室中的適當(dāng)相互作用。關(guān)節(jié)的透明軟骨，由于其對(duì)于壓力高彈性的性質(zhì)和非常均勻的表面，允許關(guān)節(jié)弱摩擦運(yùn)動(dòng)。該組織的主要部分由多種胞外基質(zhì)蛋白形成，而細(xì)胞組分——軟骨細(xì)胞——單獨(dú)或以小組(硫酸軟骨素)稀少地嵌入該基質(zhì)中。神經(jīng)纖維和血管的缺乏和導(dǎo)致的組織的氧和營(yíng)養(yǎng)物低供給，為軟骨細(xì)胞生成獨(dú)特的微環(huán)境。軟骨組織可分成多個(gè)層，其中，由于基質(zhì)分子的水平定向，最上層可抵抗摩擦，并且由于垂直定向，下方中層和下層可吸收源自運(yùn)動(dòng)的沖擊力。雖然軟骨細(xì)胞在間充質(zhì)凝聚初始過(guò)程的軟骨內(nèi)骨化過(guò)程早期出現(xiàn)并且這些細(xì)胞顯著貢獻(xiàn)于骺過(guò)程的骨生長(zhǎng)，但關(guān)節(jié)中的透明軟骨組織僅在胚胎發(fā)生過(guò)程的很晚的時(shí)間點(diǎn)發(fā)育。軟骨的完全分化的全功能層僅在出生后通過(guò)開(kāi)始組織的機(jī)械刺激才形成。在成年生物體內(nèi)，軟骨組織的穩(wěn)態(tài)高度依賴于嵌入軟骨細(xì)胞的機(jī)械負(fù)載和微環(huán)境的種類和強(qiáng)度。已做出大量努力以開(kāi)發(fā)和提供骨和軟骨組織的體外模型和測(cè)試系統(tǒng)。但是，這些方法涉及單獨(dú)提供骨或軟骨組織。因此，這些模型僅部分地和不充分地代表發(fā)生骨、骨髓和軟骨組織的發(fā)育和穩(wěn)態(tài)的天然環(huán)境。本發(fā)明的一個(gè)目的是克服現(xiàn)有技術(shù)的一個(gè)或多個(gè)問(wèn)題。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
第一方面，本發(fā)明涉及三維(3D)體外模型，其考慮軟骨和骨組織的緊密相互作用和協(xié)作。本發(fā)明提供3D體外雙相軟骨-骨類器官(organoid)，包括：a)人造軟骨組織層；和b)人造骨組織層，其中人造骨組織包括結(jié)構(gòu)提供支架和骨髓結(jié)構(gòu)；其中人造軟骨組織層接觸人造骨組織層的至少一個(gè)表面。人造軟骨組織3D體外雙相軟骨-骨類器官可利用間充質(zhì)祖細(xì)胞制備，優(yōu)選利用這樣的間充質(zhì)祖細(xì)胞：其包括至少50％的下列細(xì)胞或由下列細(xì)胞組成：CD105+、CD106+、CD44+、CD73+、CD90+和CD13+，更優(yōu)選來(lái)自分離的原代軟骨細(xì)胞。具體地，人造軟骨組織可通過(guò)下文所述的本發(fā)明方法制備。本發(fā)明的3D體外雙相軟骨-骨類器官的人造骨組織的骨髓結(jié)構(gòu)通過(guò)在結(jié)構(gòu)提供支架上接種間充質(zhì)干細(xì)胞來(lái)制備。人造骨組織的骨髓結(jié)構(gòu)優(yōu)選通過(guò)如下制備：在結(jié)構(gòu)提供支架上接種間充質(zhì)干細(xì)胞，和在結(jié)構(gòu)提供支架上培養(yǎng)間充質(zhì)干細(xì)胞2至10天，優(yōu)選5至8天，更優(yōu)選7天后，添加造血干細(xì)胞。本發(fā)明的3D體外雙相軟骨-骨類器官的人造骨組織的結(jié)構(gòu)提供支架優(yōu)選包括下列或由下列組成：生物學(xué)或非生物學(xué)材料，更優(yōu)選3D陶瓷支架。根據(jù)另一方面，本發(fā)明涉及生產(chǎn)本發(fā)明的3D體外雙相軟骨-骨類器官的方法。所述方法包括下列步驟或由下列步驟組成：-在結(jié)構(gòu)提供支架上接種間充質(zhì)干細(xì)胞；-在所述結(jié)構(gòu)提供支架上培養(yǎng)所述間充質(zhì)干細(xì)胞2至10天，優(yōu)選5至8天，更優(yōu)選7天；-向結(jié)構(gòu)提供支架上培養(yǎng)的間充質(zhì)干細(xì)胞添加造血干細(xì)胞，和培養(yǎng)所得混合物至少5天，優(yōu)選5天至8周，更優(yōu)選1周至4周，從而制備人造骨組織層，其包括接種有骨髓結(jié)構(gòu)的結(jié)構(gòu)提供支架；-提供通過(guò)權(quán)利要求13至15中任一項(xiàng)所述方法制備的人造軟骨組織；和-將所述人造軟骨組織層布置于所述人造骨組織層的至少一個(gè)表面上。根據(jù)另一方面，本發(fā)明涉及移植物，其包括本發(fā)明的3D體外雙相軟骨-骨類器官。進(jìn)一步，本發(fā)明提供藥物組合物，其包括本發(fā)明的3D體外雙相軟骨-骨類器官或本發(fā)明的移植物和至少一種藥學(xué)上可接受的賦形劑。本發(fā)明還涉及體外篩選調(diào)節(jié)軟骨或骨組織的性質(zhì)的物質(zhì)的方法，包括下列步驟：-提供本發(fā)明的3D體外雙相軟骨-骨類器官的樣品；-將各個(gè)樣品分成多個(gè)部分；-用待篩選物質(zhì)溫育至少一個(gè)部分；和-比較已處理部分與未用待篩選物質(zhì)溫育的另一部分的測(cè)量參數(shù)。根據(jù)本發(fā)明的進(jìn)一步方面，提供自我包含式3D體外雙相軟骨-骨類器官在芯片上的裝置，其包括至少一個(gè)介質(zhì)供給儲(chǔ)器、至少一個(gè)器官生長(zhǎng)部件，該器官生長(zhǎng)部件包括至少一個(gè)器官腔，容納本發(fā)明的3D體外雙相軟骨-骨類器官，其中介質(zhì)供給儲(chǔ)器通過(guò)微流體供給通道連接于該至少一個(gè)器官生長(zhǎng)部件。本發(fā)明還涉及制備軟骨形成細(xì)胞聚集體的方法，包括步驟：a)提供間充質(zhì)祖細(xì)胞；和b)在非附著條件下培養(yǎng)間充質(zhì)祖細(xì)胞，以形成軟骨形成細(xì)胞聚集體。本方法使用的間充質(zhì)祖細(xì)胞優(yōu)選包括至少50％的下列細(xì)胞或由下列細(xì)胞組成：CD105+、CD106+、CD44+、CD73+、CD90+和CD13+。更優(yōu)選地，所述間充質(zhì)祖細(xì)胞包括下列或由下列組成：分離的原代軟骨細(xì)胞。本發(fā)明基于如下發(fā)現(xiàn)：骨組織或軟骨組織的發(fā)育和穩(wěn)態(tài)受這兩種組織的存在和相互作用影響。早已知道，骨組織的形成和分化受施加于發(fā)育中的骨的物理力的存在、延伸和方向影響。在天然環(huán)境中，這些力通常通過(guò)其與軟骨組織的接觸表面施加于骨組織。軟骨組織的一個(gè)功能是使來(lái)自身體運(yùn)動(dòng)的沖擊力適當(dāng)?shù)剞D(zhuǎn)移至下方骨組織。這種相互作用不僅對(duì)骨組織的定向和強(qiáng)度有影響，而且還影響骨中骨髓和干細(xì)胞生態(tài)位的限定和組構(gòu)(organization)。毫無(wú)疑問(wèn)，骨髓和干細(xì)胞生態(tài)位的組構(gòu)和分化對(duì)個(gè)體免疫系統(tǒng)具有顯著影響。因此，兩種組織——骨組織和軟骨組織——應(yīng)被認(rèn)為形成一個(gè)共同的器官。本發(fā)明的3D體外雙相軟骨-骨類器官表現(xiàn)了這種情況，并且允許模擬這兩種組織的存在對(duì)骨組織——分別對(duì)骨髓和干細(xì)胞生態(tài)位的組構(gòu)和分化——和軟骨組織的發(fā)育和分化的影響。因此，本發(fā)明的3D體外雙相軟骨-骨類器官第一次能夠研究這兩種組織類型的緊密相互作用的相互影響。具體地，如果將3D體外雙相軟骨-骨類器官用于測(cè)試系統(tǒng)——其中人造軟骨組織層可通過(guò)機(jī)械刺激暴露于限定物理力，則提供這樣的模型系統(tǒng)：接近地模擬天然情況，因此能夠?qū)崿F(xiàn)對(duì)這些組織生物學(xué)的新見(jiàn)解，以及能夠?qū)崿F(xiàn)對(duì)與這些組織或過(guò)程相互作用的物質(zhì)的適當(dāng)篩選系統(tǒng)。在下文中，更詳細(xì)地提供本發(fā)明的不同方面。如此限定的各方面可與任意其他一個(gè)或多個(gè)方面組合，除非明確相反陳述。具體地，作為優(yōu)選或優(yōu)勢(shì)顯示的任意特征可與作為本發(fā)明的部分顯示或作為優(yōu)選或優(yōu)勢(shì)顯示的任意其他一個(gè)或多個(gè)特征組合。本發(fā)明涉及3D體外雙相軟骨-骨類器官?；诒景l(fā)明的目的，術(shù)語(yǔ)“類器官”表示體外不同細(xì)胞類型的人造的、從頭生成的、功能細(xì)胞聚集體，其顯示出各器官或組織的至少一個(gè)一般功能，優(yōu)選顯示各器官或組織的大部分一般功能。本發(fā)明的3D體外雙相軟骨-骨類器官包括人造軟骨組織層。人造軟骨組織是從頭和體外制備和組裝的軟骨組織。通常，人造軟骨組織包括完全或至少部分分化的軟骨細(xì)胞和胞外基質(zhì)組分——包括膠原蛋白II、IX和XI。技術(shù)人員可利用多種技術(shù)制備體外人造軟骨組織。由于軟骨組織通常不止包括軟骨細(xì)胞的簡(jiǎn)單2D層，優(yōu)選3D培養(yǎng)技術(shù)生成的人造軟骨組織。適當(dāng)?shù)募夹g(shù)被總結(jié)于Tortelli和Cancedda中(“Three-dimensionalculturesofosteogenicandchondrogeniccells:Atissueengineeringapproachtomimicboneandcartilageinvitro”,EuropeanCellsandMaterials(2009),17,1-14)。人造軟骨組織層可例如得自如下技術(shù)：包括通過(guò)水凝膠封裝、微團(tuán)(micromass)培養(yǎng)、形成高密度細(xì)胞團(tuán)塊和應(yīng)用生物相容性可降解的或非可降解的支架來(lái)培養(yǎng)和/或組構(gòu)細(xì)胞或細(xì)胞聚集體。根據(jù)本發(fā)明的制備人造軟骨組織的另一優(yōu)選方法在下文中被進(jìn)一步描述為制備軟骨形成細(xì)胞聚集體的方法。為提供人造軟骨組織層，利用間充質(zhì)干細(xì)胞(MCS)——也被稱為間充質(zhì)祖細(xì)胞——制備人造軟骨組織。優(yōu)選地，利用分離的間充質(zhì)祖細(xì)胞。術(shù)語(yǔ)“分離的”意為間充質(zhì)祖細(xì)胞是已被從天然來(lái)源分離，或代表其子代——例如已通過(guò)細(xì)胞增殖而衍生——的細(xì)胞。所用間充質(zhì)祖細(xì)胞優(yōu)選衍生自供體——個(gè)體或患者——的軟骨組織。優(yōu)選地，間充質(zhì)祖細(xì)胞是還未被轉(zhuǎn)化或永生化的原代細(xì)胞。具體地，間充質(zhì)祖細(xì)胞可包括成年間充質(zhì)祖細(xì)胞或由成年間充質(zhì)祖細(xì)胞組成。這種成年間充質(zhì)祖細(xì)胞衍生自供體——個(gè)體或患者——的非胚胎軟骨組織。間充質(zhì)祖細(xì)胞可衍生自已分化以包括軟骨組織的任意供體組織的軟骨組織。優(yōu)選地，間充質(zhì)祖細(xì)胞衍生自關(guān)節(jié)的軟骨組織，更優(yōu)選供體的膝或肘的軟骨。間充質(zhì)祖細(xì)胞優(yōu)選是人細(xì)胞。人間充質(zhì)祖細(xì)胞衍生自人源的軟骨組織。間充質(zhì)祖細(xì)胞可包括至少50％的如下細(xì)胞：CD105+、CD106+、CD44+、CD73+、CD90+和CD13+，或可由如下細(xì)胞組成：CD105+、CD106+、CD44+、CD73+、CD90+和CD13+。優(yōu)選地，間充質(zhì)祖細(xì)胞包括下列或由下列組成：分離的原代軟骨細(xì)胞，如例如人原代軟骨細(xì)胞。本發(fā)明的3D體外雙相軟骨-骨類器官包括人造骨組織層，其中人造骨組織包括結(jié)構(gòu)提供支架和骨髓結(jié)構(gòu)。人造骨組織是已從頭和體外制備和組裝的骨組織。通常，人造骨組織包括完全或部分分化的成骨細(xì)胞、破骨細(xì)胞和造血干細(xì)胞。技術(shù)人員可利用多種技術(shù)制備體外人造骨組織。由于骨組織通常不止包括某細(xì)胞類型的簡(jiǎn)單2D層，優(yōu)選3D培養(yǎng)技術(shù)生成的人造骨組織。適當(dāng)?shù)募夹g(shù)被總結(jié)于Tortelli和Cancedda中(“Three-dimensionalculturesofosteogenicandchondrogeniccells:Atissueengineeringapproachtomimicboneandcartilageinvitro”,EuropeanCellsandMaterials(2009),17,1-14)。人造骨組織層可例如得自如下技術(shù)：包括通過(guò)微團(tuán)培養(yǎng)和應(yīng)用生物相容性可降解的或非可降解的支架來(lái)培養(yǎng)和/或組構(gòu)細(xì)胞或細(xì)胞聚集體。適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)技術(shù)和支架在本領(lǐng)域已知。例如可應(yīng)用包括生物學(xué)或非生物學(xué)材料或由生物學(xué)或非生物學(xué)材料組成的生物可降解的或非可降解的支架。合成型聚合物用作支架以及膠原蛋白型支架、金屬型支架如例如鈦型支架、或陶瓷型支架的應(yīng)用已被描述。用于制備人造骨組織的細(xì)胞可包括間充質(zhì)干細(xì)胞(MSC)和造血干細(xì)胞(HSC)。優(yōu)選地，應(yīng)用分離的MSCs和/或分離的HSCs。術(shù)語(yǔ)“分離的”意為MSCs和/或HSCs是已被從天然來(lái)源分離或代表其子代——例如已通過(guò)細(xì)胞增殖衍生——的細(xì)胞。所用的MSCs和/或HSCs優(yōu)選衍生自供體——個(gè)體或患者——的適當(dāng)組織。優(yōu)選地，MSCs和/或HSCs是還未轉(zhuǎn)化或未永生化的原代細(xì)胞。具體地，MSCs和/或HSCs可包括下列或由下列組成：成年MSCs和/或HSCs。這種成年MSCs和/或HSCs衍生自供體——個(gè)體或患者——的非胚胎組織，優(yōu)選骨或骨髓組織。MSCs和/或HSCs優(yōu)選是人細(xì)胞。人MSCs和/或HSCs優(yōu)選衍生自人源骨或骨髓組織。根據(jù)本發(fā)明的制備人造骨組織的優(yōu)選方法包括在陶瓷3D支架上接種和培養(yǎng)MSCs。將被棲居的陶瓷3D支架培養(yǎng)預(yù)定時(shí)間段，隨后可添加HSCs。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，在陶瓷支架上培養(yǎng)MSCs2至10天后添加HSCs。然后將被棲居的陶瓷3D支架在靜態(tài)培養(yǎng)條件下或在連續(xù)營(yíng)養(yǎng)物供應(yīng)灌注系統(tǒng)中進(jìn)一步培養(yǎng)。生成人造骨組織的技術(shù)可被進(jìn)一步改動(dòng)。例如，可添加生長(zhǎng)因子或其他信號(hào)傳導(dǎo)分子以支持骨髓功能?？蓱?yīng)用低氧條件，其類似于骨髓必須面對(duì)的天然條件。培養(yǎng)時(shí)間以及給予支架不同細(xì)胞類型的順序可能必須被優(yōu)化。除MSCs和HSCs外，進(jìn)一步的細(xì)胞類型也可用于生成人造骨組織。這些另外的細(xì)胞可包括通常存在于骨或骨髓結(jié)構(gòu)中的細(xì)胞類型，例如免疫細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞及類似細(xì)胞類型。本發(fā)明的3D體外雙相軟骨-骨類器官可用作體外和/或體內(nèi)的研究工具。其可用于研究生物學(xué)或其組分的一種或多種?？蛇x地，其可用于體外和/或體內(nèi)篩選調(diào)節(jié)軟骨或骨組織性質(zhì)的物質(zhì)的方法。本發(fā)明還涉及包括本發(fā)明的3D體外雙相軟骨-骨類器官的移植物和包括本發(fā)明的3D體外雙相軟骨-骨類器官或本發(fā)明的移植物和至少一種藥學(xué)上可接受的賦形劑的藥物組合物。在進(jìn)一步方面，本發(fā)明涉及體外篩選調(diào)節(jié)軟骨或骨組織性質(zhì)的物質(zhì)的方法，包括步驟：-提供本發(fā)明的3D體外雙相軟骨-骨類器官的樣品；-將各樣品分成多個(gè)部分；-用待篩選物質(zhì)溫育至少一個(gè)部分；和-比較已處理部分與未用待篩選物質(zhì)溫育的另一部分的測(cè)量參數(shù)。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，在用待篩選物質(zhì)溫育該部分前，使該部分經(jīng)過(guò)自我包含式器官在芯片上的裝置。簡(jiǎn)言之，本發(fā)明方法，通過(guò)本發(fā)明的3D體外雙相軟骨-骨類器官，使對(duì)軟骨或骨組織產(chǎn)生影響的物質(zhì)的鑒定和分析成為可能。樣品——根據(jù)本發(fā)明應(yīng)被理解為包括一定數(shù)量的產(chǎn)物對(duì)象——被分成多個(gè)部分。提供至少兩個(gè)子組；一組用于篩選，而另一組充當(dāng)陰性對(duì)照。優(yōu)選地，篩選部分的數(shù)量超過(guò)對(duì)照部分的數(shù)量。通常，多個(gè)部分進(jìn)行高通量篩選。在本發(fā)明方法中待篩選的物質(zhì)不以任何方式受限。在本發(fā)明的實(shí)施方式中，物質(zhì)選自核酸——包括RNAi、核糖酶、適配子(aptamers)、抗體、肽、糖、聚合物、分子量在50和1.000Da之間的小分子、和蛋白質(zhì)——優(yōu)選抗體、細(xì)胞因子和脂鈣蛋白。這些物質(zhì)通?？稍趲?kù)中獲得。優(yōu)選在樣品的不同部分中溫育單種化合物。但是，也可以通過(guò)在一個(gè)部分中溫育至少兩種物質(zhì)來(lái)研究物質(zhì)的協(xié)同效應(yīng)。將另一個(gè)子組的對(duì)象在不存在物質(zhì)的情況下同時(shí)溫育。溫育過(guò)程取決于多種參數(shù)，例如細(xì)胞類型和檢測(cè)靈敏度，其優(yōu)化按照本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的常規(guī)程序。根據(jù)本發(fā)明的有效物質(zhì)鑒定優(yōu)選間接進(jìn)行，例如通過(guò)確定改變的表達(dá)圖譜和/或細(xì)胞生活力。可在特定時(shí)間進(jìn)行確定，并與實(shí)驗(yàn)開(kāi)始時(shí)的信號(hào)強(qiáng)度和陰性對(duì)照關(guān)聯(lián)。適當(dāng)?shù)臏y(cè)試本領(lǐng)域技術(shù)人員已知或可容易按常規(guī)設(shè)計(jì)。本發(fā)明還公開(kāi)了自我包含式3D體外雙相軟骨-骨類器官在芯片上的裝置，其包括如WO2009/146911描述的自我包含式器官在芯片上的裝置和本發(fā)明的3D體外雙相軟骨-骨類器官。形成本發(fā)明的自我包含式3D體外雙相軟骨-骨類器官在芯片上的裝置，以允許建立或保持小型化芯片形式的本發(fā)明的3D體外雙相軟骨-骨類器官，小型化芯片形式適于通過(guò)活細(xì)胞成像和例如雙光子顯微術(shù)在線觀察及其如下的應(yīng)用：例如測(cè)試化合物的活性、藥效學(xué)和藥代動(dòng)力學(xué)，或研究器官或類器官和干細(xì)胞生態(tài)位的自組裝、穩(wěn)態(tài)、破壞、再生或相互作用，以及成熟、衰老、死亡和生物鐘學(xué)現(xiàn)象。因此，本發(fā)明的自我包含式3D體外雙相軟骨-骨類器官在芯片上的裝置包括至少一個(gè)介質(zhì)供給儲(chǔ)器、至少一個(gè)器官生長(zhǎng)部件——包括至少一個(gè)器官腔，容納本發(fā)明的3D體外雙相軟骨-骨類器官，其中介質(zhì)供給儲(chǔ)器通過(guò)微流體供給通道連接于至少一個(gè)器官生長(zhǎng)部件。本發(fā)明的主題允許建立包括軟骨和骨組織的類器官的小型化體外培養(yǎng)物。所得的本發(fā)明的3D體外雙相軟骨-骨類器官例如在允許連續(xù)供應(yīng)氧和營(yíng)養(yǎng)物的條件如例如連續(xù)灌注條件下培養(yǎng)時(shí)適于上至3個(gè)月的長(zhǎng)時(shí)間培養(yǎng)。本發(fā)明的主題允許機(jī)械刺激的整合——以模擬例如源自身體運(yùn)動(dòng)的物理力，和類器官中血管結(jié)構(gòu)的引入——因此，提供接近于天然情況的環(huán)境?；谶@些性質(zhì)，本發(fā)明的主題允許產(chǎn)生在組織工程、細(xì)胞和組織分化分子生物學(xué)以及再生藥物領(lǐng)域的多種科學(xué)發(fā)現(xiàn)。本發(fā)明的主題還可導(dǎo)致成本和勞動(dòng)密集型動(dòng)物實(shí)驗(yàn)被體外測(cè)試替代。當(dāng)前，還未有嘗試提供與長(zhǎng)期培養(yǎng)技術(shù)如灌注培養(yǎng)相容并且允許引入血管系統(tǒng)的、在一個(gè)單獨(dú)的整合系統(tǒng)中組合功能上相互關(guān)聯(lián)的組織骨、骨髓和軟骨的3D體外類器官。通過(guò)使系統(tǒng)暴露于機(jī)械力或其他刺激，將會(huì)在此前從未達(dá)到的程度上模擬天然環(huán)境。另一方面，本發(fā)明涉及體外制備軟骨形成細(xì)胞聚集體的方法。該方法包括步驟：a)提供分離的間充質(zhì)祖細(xì)胞；和b)在非附著條件下培養(yǎng)間充質(zhì)祖細(xì)胞，以形成軟骨形成細(xì)胞聚集體。已經(jīng)驚人地發(fā)現(xiàn)，分離的間充質(zhì)祖細(xì)胞能夠形成三維細(xì)胞聚集體，其呈現(xiàn)軟骨形成分化，而不影響胚胎細(xì)胞。這種效果通過(guò)在非附著條件下培養(yǎng)間充質(zhì)祖細(xì)胞而實(shí)現(xiàn)。可顯示，在這種非附著培養(yǎng)條件下，間充質(zhì)祖細(xì)胞相互自由排列并凝聚成細(xì)胞聚集體，其呈現(xiàn)對(duì)軟骨形成分化的特異性標(biāo)記的表達(dá)，并且因此指示軟骨形成細(xì)胞聚集體。在下文中，更詳細(xì)地提供本發(fā)明的不同方面。如此限定的各方面可與任意其他方面或方面組合，除非明確相反陳述。具體地，作為優(yōu)選或優(yōu)勢(shì)顯示的任意特征可與作為本發(fā)明的部分顯示或作為優(yōu)選或優(yōu)勢(shì)顯示的任意其他特征或特征組合。本發(fā)明的方法涉及體外軟骨形成細(xì)胞聚集體的制備。基于本發(fā)明的目的，術(shù)語(yǔ)“軟骨形成細(xì)胞聚集體”指代呈現(xiàn)對(duì)軟骨細(xì)胞或軟骨組織特異的至少一個(gè)功能的功能細(xì)胞聚集體。優(yōu)選地，本發(fā)明的軟骨形成細(xì)胞聚集體呈現(xiàn)分化軟骨細(xì)胞或軟骨組織的大部分或基本上全部的器官或組織功能。具體地，本發(fā)明的軟骨形成細(xì)胞聚集體可表現(xiàn)如同功能軟骨組織和/或能夠在體外和/或體內(nèi)誘導(dǎo)軟骨發(fā)育或分化。本發(fā)明的軟骨形成細(xì)胞聚集體可特征在于與軟骨細(xì)胞或軟骨組織發(fā)育或分化有關(guān)的標(biāo)記基因或蛋白質(zhì)的表達(dá)升高。優(yōu)選地，本發(fā)明的軟骨形成細(xì)胞聚集體可特征在于，與間充質(zhì)祖細(xì)胞在經(jīng)歷非附著培養(yǎng)條件前即刻的表達(dá)相比，膠原蛋白II、IX和XI的上調(diào)表達(dá)以及膠原蛋白I和XII的下調(diào)表達(dá)。本發(fā)明的軟骨形成細(xì)胞聚集體通過(guò)本發(fā)明的方法形成。軟骨形成細(xì)胞聚集體可呈現(xiàn)基本上圓形或球形的細(xì)胞聚集體。其可具有0,5mm至3mm的平均直徑，優(yōu)選0,5mm至2mm的平均直徑。本發(fā)明的軟骨形成細(xì)胞聚集體不具有非源自用于生產(chǎn)軟骨形成細(xì)胞聚集體的細(xì)胞的任何人造生物學(xué)或非生物學(xué)支架或載體。本發(fā)明的軟骨形成細(xì)胞聚集體優(yōu)選由本發(fā)明方法形成的細(xì)胞聚集體組成，其中該方法已在不使用或添加非直接源自用于所述方法的細(xì)胞的任意生物學(xué)或非生物學(xué)支架或載體的情況下進(jìn)行。在本發(fā)明的方法中，使用分離的間充質(zhì)祖細(xì)胞。術(shù)語(yǔ)“分離的”意為間充質(zhì)祖細(xì)胞是已從天然來(lái)源分離的細(xì)胞或其子代——其例如已通過(guò)細(xì)胞增殖衍生——分離的細(xì)胞。所用的間充質(zhì)祖細(xì)胞優(yōu)選衍生自供體——個(gè)體或患者——的軟骨組織。優(yōu)選地，間充質(zhì)祖細(xì)胞是還未轉(zhuǎn)化或未永生化的原代細(xì)胞。具體地，間充質(zhì)祖細(xì)胞可包括成年間充質(zhì)祖細(xì)胞或由成年間充質(zhì)祖細(xì)胞組成。這種成年間充質(zhì)祖細(xì)胞衍生自供體——個(gè)體或患者——的非胚胎軟骨組織。間充質(zhì)祖細(xì)胞可衍生自已分化以包括軟骨組織的任意供體組織的軟骨組織。優(yōu)選地，間充質(zhì)祖細(xì)胞衍生自供體的關(guān)節(jié)的軟骨組織，更優(yōu)選膝或肘的軟骨。用于本發(fā)明方法的間充質(zhì)祖細(xì)胞優(yōu)選是人細(xì)胞。人間充質(zhì)祖細(xì)胞衍生自人源軟骨組織。間充質(zhì)祖細(xì)胞可包括至少50％的如下細(xì)胞：CD105+、CD106+、CD44+、CD73+、CD90+和CD13+，或可由如下細(xì)胞組成：CD105+、CD106+、CD44+、CD73+、CD90+和CD13+。優(yōu)選地，間充質(zhì)祖細(xì)胞包括下列或由下列組成：分離的原代軟骨細(xì)胞，如例如人原代軟骨細(xì)胞。在本發(fā)明的方法中，間充質(zhì)祖細(xì)胞可經(jīng)歷在分離后的任意階段、在非附著條件下的培養(yǎng)。但是，如果間充質(zhì)祖細(xì)胞已在附著2D單層條件下進(jìn)行至少一些培養(yǎng)，則會(huì)進(jìn)一步增強(qiáng)細(xì)胞聚集體的形成。優(yōu)選地，間充質(zhì)祖細(xì)胞在進(jìn)行在非附著條件下培養(yǎng)前已在2D單層培養(yǎng)中被培養(yǎng)至少5代。為確保去分化表型，需要在2D單層附著條件中培養(yǎng)間充質(zhì)祖細(xì)胞至少10代。細(xì)胞聚集體形成的高效力保持在很多代中。但是，已發(fā)現(xiàn)，如果間充質(zhì)祖細(xì)胞已在2D單層培養(yǎng)中被培養(yǎng)至少5代和不多于20代，則實(shí)現(xiàn)最佳結(jié)果。優(yōu)選地，間充質(zhì)祖細(xì)胞在分離后在2D單層中培養(yǎng)至少5代和不多于15代后進(jìn)行非附著培養(yǎng)。在本發(fā)明的方法中，在提供分離的間充質(zhì)祖細(xì)胞后，使間充質(zhì)祖細(xì)胞經(jīng)歷非附著培養(yǎng)條件，以形成軟骨形成細(xì)胞聚集體。如果間充質(zhì)祖細(xì)胞在特定濃度下經(jīng)歷非附著培養(yǎng)條件，則細(xì)胞聚集體的形成尤其有效。如果濃度過(guò)低，則細(xì)胞相互僅極少接觸，向細(xì)胞聚集體的凝聚有效性較小。另一方面，如果間充質(zhì)祖細(xì)胞的濃度過(guò)高，細(xì)胞靈活性或移動(dòng)性較小，因此，細(xì)胞聚集體的形成有效性較小。優(yōu)選地，間充質(zhì)祖細(xì)胞在5×104至5×107/ml的濃度下經(jīng)歷非附著培養(yǎng)條件。如果間充質(zhì)祖細(xì)胞在1×105至1×107/ml，優(yōu)選5×105至5×106/ml，和最優(yōu)選9×105至1,1×106/ml的濃度下經(jīng)歷非附著培養(yǎng)條件，會(huì)實(shí)現(xiàn)更好的結(jié)果。在本發(fā)明的方法中，在非附著培養(yǎng)條件下培養(yǎng)分離的間充質(zhì)祖細(xì)胞。這意為在如下條件下培養(yǎng)間充質(zhì)祖細(xì)胞：其中細(xì)胞不采取顯示強(qiáng)依附和附著于培養(yǎng)表面的扁平、散開(kāi)的形狀。優(yōu)選地，間充質(zhì)祖細(xì)胞在接種后保持圓形，如果這樣的話，僅弱關(guān)聯(lián)于培養(yǎng)表面。適當(dāng)?shù)姆歉街?xì)胞培養(yǎng)手段在本領(lǐng)域公知。非附著培養(yǎng)條件可包括在具有不支持間充質(zhì)祖細(xì)胞附著的培養(yǎng)表面的培養(yǎng)容器中培養(yǎng)間充質(zhì)祖細(xì)胞。例如，可使用具有呈現(xiàn)超低細(xì)胞依附的培養(yǎng)表面的培養(yǎng)容器。因此，可使用具有中性或帶正電的培養(yǎng)表面的培養(yǎng)容器。優(yōu)選地，培養(yǎng)表面可被進(jìn)一步減少間充質(zhì)祖細(xì)胞和培養(yǎng)表面相互作用的材料層涂布。培養(yǎng)表面可覆有親水水凝膠。顯示在非附著培養(yǎng)條件下間充質(zhì)祖細(xì)胞相當(dāng)迅速地締合并凝聚成細(xì)胞聚集體。在非附著細(xì)胞培養(yǎng)24小時(shí)后，間充質(zhì)祖細(xì)胞聚集成一個(gè)大復(fù)合體。但是，為制備代表具有進(jìn)展的發(fā)育、分化和/或功能的軟骨形成細(xì)胞聚集體的細(xì)胞聚集體，進(jìn)行非附著培養(yǎng)超過(guò)24小時(shí)的一段時(shí)間是有益的。在本發(fā)明的方法中，可在非附著條件下培養(yǎng)間充質(zhì)祖細(xì)胞至少48小時(shí)，優(yōu)選至少72小時(shí)，更優(yōu)選至少1周，還更優(yōu)選至少2周，最優(yōu)選至少4周。因此，可在非附著條件下培養(yǎng)間充質(zhì)祖細(xì)胞48小時(shí)至8周，優(yōu)選60小時(shí)至6周，更優(yōu)選72小時(shí)至5周。在普通培養(yǎng)皿中培養(yǎng)后，聚集體附著皿表面，并且細(xì)胞開(kāi)始遷移和增殖，導(dǎo)致聚集體結(jié)構(gòu)瓦解。因此，聚集體優(yōu)選在整個(gè)培養(yǎng)期間保持在非附著條件下。在本發(fā)明的方法中，優(yōu)選在非附著條件下培養(yǎng)間充質(zhì)祖細(xì)胞，至少直到呈現(xiàn)圓形的細(xì)胞聚集體形成，其具有0,5mm至3mm的平均直徑，更優(yōu)選0,5mm至2mm的平均直徑。通過(guò)本發(fā)明方法生成的軟骨形成細(xì)胞聚集體的適應(yīng)性取決于其誘導(dǎo)或提供分化軟骨細(xì)胞或軟骨組織的能力。因此，優(yōu)選在非附著條件下培養(yǎng)分離的間充質(zhì)祖細(xì)胞，直到所得細(xì)胞聚集體開(kāi)始呈現(xiàn)部分或完全分化的軟骨細(xì)胞或軟骨組織的性質(zhì)和/或功能?？赏ㄟ^(guò)各標(biāo)記基因、蛋白質(zhì)或結(jié)構(gòu)的相對(duì)表達(dá)監(jiān)測(cè)分化進(jìn)程。優(yōu)選地，在非附著條件下培養(yǎng)分離的間充質(zhì)祖細(xì)胞，至少直到形成的細(xì)胞聚集體，與經(jīng)歷非附著培養(yǎng)條件前即刻的間充質(zhì)祖細(xì)胞表達(dá)相比，呈現(xiàn)膠原蛋白II、IX和XI上調(diào)表達(dá)以及膠原蛋白I和XII下調(diào)表達(dá)。由于階段特異標(biāo)記分子的表達(dá)分析揭示保持的N-鈣粘蛋白表達(dá)和膠原蛋白II型的升高水平而非膠原蛋白X型的表達(dá)，因此表明在軟骨形成前體和柱形軟骨細(xì)胞之間的分化表型而非至肥大前階段的進(jìn)一步分化。這種表型反映出在關(guān)節(jié)軟骨組織中捕獲的軟骨細(xì)胞表型?；虻南鄬?duì)表達(dá)水平通過(guò)公知方法可容易確定，如例如定量或半定量RT-PCR或RNA印跡法。蛋白質(zhì)的相對(duì)表達(dá)水平也可通過(guò)公知方法確定，如例如蛋白質(zhì)印跡法和ELISA技術(shù)。除關(guān)于mRNA和蛋白質(zhì)水平的表達(dá)模式分析外，進(jìn)一步通過(guò)免疫組織化學(xué)染色以及抗壓性測(cè)定進(jìn)行的聚集體結(jié)構(gòu)的詳細(xì)表征也被包括，以指定聚集體的質(zhì)量(quality)?，F(xiàn)有技術(shù)中大多數(shù)方法遭遇的缺點(diǎn)之一是，在這些方法中，需要存在人造生物學(xué)或非生物學(xué)支架或載體，在其上或其中培養(yǎng)細(xì)胞以形成軟骨組織。生物學(xué)或非生物學(xué)支架或載體被認(rèn)為是人造的或添加的——如果所述支架或載體是從外部提供的和不是直接由在細(xì)胞聚集體形成期間用于本發(fā)明方法的細(xì)胞形成。在本發(fā)明的方法中，無(wú)需這種人造生物學(xué)或非生物學(xué)支架或載體的使用或存在。本發(fā)明的方法在不使用任何這種非源自所用細(xì)胞的人造生物學(xué)或非生物學(xué)支架或載體的情況下生成根據(jù)本發(fā)明所述的軟骨形成細(xì)胞聚集體。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，實(shí)施本發(fā)明的方法，使得在軟骨形成細(xì)胞聚集體形成過(guò)程中不添加生物學(xué)或非生物學(xué)支架。在本發(fā)明的方法中，利用標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基，在附著或非附著條件下培養(yǎng)間充質(zhì)祖細(xì)胞。無(wú)需特殊培養(yǎng)基以在非附著條件下誘導(dǎo)適當(dāng)細(xì)胞聚集。技術(shù)人員公知適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基。一般，使用標(biāo)準(zhǔn)DMEM并帶有一定含量的胎牛血清(FCS)，優(yōu)選FCS存在的濃度為5％至15％，更優(yōu)選濃度為10％的FCS。盡管事實(shí)上適當(dāng)?shù)能浌切纬煞只诰奂w形成后被誘導(dǎo)而無(wú)需額外的處理，但進(jìn)一步優(yōu)化可以是有益的。因此，在本發(fā)明的方法中，一旦聚集過(guò)程完成，關(guān)于生長(zhǎng)因子給予或低氧條件下培養(yǎng)的進(jìn)一步優(yōu)化步驟將進(jìn)一步改善發(fā)育和分化。本發(fā)明還涉及移植物，其包括下列或由下列組成：本發(fā)明的人造軟骨形成細(xì)胞聚集體或由其衍生的組織或結(jié)構(gòu)。在本發(fā)明另一方面，提供藥物組合物，其包括本發(fā)明的人造軟骨形成細(xì)胞聚集體、由其衍生的組織或結(jié)構(gòu)或本發(fā)明的移植物和至少一種藥學(xué)上可接受的賦形劑。本發(fā)明的人造軟骨形成細(xì)胞聚集體、本發(fā)明的移植物或本發(fā)明的藥物組合物可用于治療軟骨損傷和/或破壞或軟骨損失。由于本發(fā)明的方法利用衍生自非胚胎來(lái)源的分離的間充質(zhì)祖細(xì)胞發(fā)揮作用，該方法允許從得自具體供體或患者的細(xì)胞開(kāi)始產(chǎn)生人造軟骨形成細(xì)胞聚集體。因此，可以提供已經(jīng)從將要用本發(fā)明的人造軟骨形成細(xì)胞聚集體、藥物組合物或移植物治療的人的細(xì)胞衍生的人造軟骨形成細(xì)胞聚集體。因此，顯示可以提供這樣的移植物：其主要、基本上或完全衍生自移植物受體本身的細(xì)胞，使得排斥反應(yīng)將減少至最小或完全不存在。本發(fā)明的人造軟骨形成細(xì)胞聚集體可用于體外或體內(nèi)生成分化的軟骨細(xì)胞或軟骨組織。本發(fā)明的人造軟骨形成細(xì)胞聚集體、本發(fā)明的移植物或本發(fā)明的藥物組合物可用作可體外和體內(nèi)使用的研究工具。本發(fā)明的人造軟骨形成細(xì)胞聚集體、本發(fā)明的移植物或本發(fā)明的藥物組合物可用于體外或體內(nèi)篩選調(diào)節(jié)軟骨細(xì)胞或軟骨組織性質(zhì)的物質(zhì)的方法。本發(fā)明另外教導(dǎo)了體外篩選調(diào)節(jié)軟骨細(xì)胞或軟骨組織性質(zhì)的物質(zhì)的方法，包括步驟：-提供本發(fā)明的人造軟骨形成細(xì)胞聚集體或通過(guò)本發(fā)明方法制備的細(xì)胞聚集體或由其衍生的組織的樣品；-將各樣品分成多個(gè)部分；-用待篩選物質(zhì)溫育至少一個(gè)部分；和-比較已處理部分與未用待篩選物質(zhì)溫育的另一部分的測(cè)量參數(shù)。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，在用待篩選物質(zhì)溫育該部分前，使該部分經(jīng)過(guò)自我包含式器官在芯片上的裝置。簡(jiǎn)言之，本發(fā)明方法，通過(guò)本發(fā)明的人造軟骨形成細(xì)胞聚集體，使對(duì)軟骨細(xì)胞或軟骨組織具有影響的物質(zhì)的鑒定和分析成為可能。樣品——根據(jù)本發(fā)明應(yīng)被理解為包括一定數(shù)量的產(chǎn)物對(duì)象——被分成多個(gè)部分。提供至少兩個(gè)子組；一組用于篩選，而另一組充當(dāng)陰性對(duì)照。優(yōu)選地，篩選部分的數(shù)量超過(guò)對(duì)照部分的數(shù)量。通常，多個(gè)部分進(jìn)行高通量篩選。在本發(fā)明方法中待篩選的物質(zhì)不以任何方式受限。在本發(fā)明的實(shí)施方式中，物質(zhì)選自核酸——包括RNAi、核糖酶、適配子、抗體、肽、糖、聚合物、分子量在50和1.000Da之間的小分子和蛋白質(zhì)——優(yōu)選抗體、細(xì)胞因子和脂鈣蛋白。這些物質(zhì)通常可在庫(kù)中獲得。優(yōu)選在樣品的不同部分中溫育單種化合物。但是，也可以通過(guò)在一個(gè)部分中溫育至少兩種物質(zhì)來(lái)研究物質(zhì)的協(xié)同效應(yīng)。將另一個(gè)子組的對(duì)象在不存在物質(zhì)的情況下同時(shí)溫育。溫育過(guò)程取決于多種參數(shù)，例如細(xì)胞類型和檢測(cè)靈敏度，其優(yōu)化按照本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的常規(guī)程序。根據(jù)本發(fā)明的有效物質(zhì)鑒定優(yōu)選間接進(jìn)行，例如通過(guò)確定改變的表達(dá)圖譜和/或細(xì)胞生活力?？稍谔囟〞r(shí)間進(jìn)行確定，并與實(shí)驗(yàn)開(kāi)始時(shí)的信號(hào)強(qiáng)度和陰性對(duì)照關(guān)聯(lián)。適當(dāng)?shù)臏y(cè)試本領(lǐng)域技術(shù)人員已知或可容易按常規(guī)設(shè)計(jì)。由于本發(fā)明的人造軟骨形成細(xì)胞聚集體可被認(rèn)為是器官、類器官或器官或其部分的前體，其可尤其有益于使用測(cè)試系統(tǒng)——其中可在模擬天然灌注的條件下長(zhǎng)時(shí)間制備和/或培養(yǎng)人造軟骨形成細(xì)胞聚集體。其顯示出尤其適于將本發(fā)明的方法和/或本發(fā)明的人造軟骨形成細(xì)胞聚集體結(jié)合在分析系統(tǒng)中，該分析系統(tǒng)基于申請(qǐng)?zhí)朎P10008244的歐洲專利申請(qǐng)或公開(kāi)號(hào)WO2009/146911的PCT申請(qǐng)中描述的自我包含式器官在芯片上的裝置系統(tǒng)。本發(fā)明還公開(kāi)了自我包含式人造軟骨形成細(xì)胞聚集體類器官在芯片上的裝置，其包括WO2009/146911描述的自我包含式器官在芯片上的裝置和本發(fā)明的人造軟骨形成細(xì)胞聚集體。形成本發(fā)明的自我包含式人造軟骨形成細(xì)胞聚集體類器官在芯片上的裝置以允許建立或保持小型化芯片形式的本發(fā)明的人造軟骨形成細(xì)胞聚集體，小型化芯片形式適于通過(guò)活細(xì)胞成像和例如雙光子顯微術(shù)在線觀察及其如下的應(yīng)用：例如測(cè)試化合物的活性、藥效學(xué)和藥代動(dòng)力學(xué)，或研究器官或類器官和干細(xì)胞生態(tài)位的自組裝、穩(wěn)態(tài)、破壞、再生或相互作用，以及成熟、衰老、死亡和生物鐘學(xué)現(xiàn)象。因此，本發(fā)明的自我包含式人造軟骨形成細(xì)胞聚集體類器官在芯片上的裝置包括至少一個(gè)培養(yǎng)基供給儲(chǔ)器、至少一個(gè)器官生長(zhǎng)部件——包括至少一個(gè)器官腔，容納本發(fā)明的人造軟骨形成細(xì)胞聚集體，其中培養(yǎng)基供給儲(chǔ)器通過(guò)微流體供給通道連接于至少一個(gè)器官生長(zhǎng)部件。本發(fā)明首次提供人造軟骨形成細(xì)胞聚集體及其生產(chǎn)方法，其特征在于非強(qiáng)制細(xì)胞組裝，無(wú)需任何人造生物學(xué)或非生物學(xué)支架或載體，和由成年細(xì)胞生產(chǎn)，從而無(wú)需胚胎細(xì)胞或組織。本發(fā)明的人造軟骨形成細(xì)胞聚集體代表功能誘導(dǎo)性聚集體，其能夠誘導(dǎo)或引發(fā)體外和體內(nèi)軟骨組織發(fā)育。所得軟骨組織的特征在于以生理順序排列、一般形成軟骨組織部分的結(jié)構(gòu)的可驗(yàn)證存在。附圖說(shuō)明圖1顯示去分化的軟骨細(xì)胞呈現(xiàn)間充質(zhì)干細(xì)胞特征。[A]將去分化的軟骨細(xì)胞染色，用于間充質(zhì)表面標(biāo)記組(panel)。細(xì)胞為CD105、CD106、CD44、CD73、CD90和CD13陽(yáng)性，和造血標(biāo)記CD34和CD45陰性(顯示一個(gè)代表性實(shí)驗(yàn)，n＝6)。脂肪形成性分化。[B-D]用脂肪形成性培養(yǎng)基處理去分化的軟骨細(xì)胞28天。通過(guò)光學(xué)顯微鏡術(shù)和油紅O染色評(píng)價(jià)脂肪細(xì)胞分化。B)單層細(xì)胞的陰性對(duì)照，未染色；C)單層細(xì)胞的陰性對(duì)照，油紅O染色；D)通過(guò)細(xì)胞質(zhì)中脂質(zhì)填充液滴的形成證明28天后的脂肪細(xì)胞分化；分化脂肪細(xì)胞中脂質(zhì)填充液滴的油紅O染色；(顯示一個(gè)代表性實(shí)驗(yàn)，n＝6)；成骨細(xì)胞分化。[F-G]用成骨培養(yǎng)基處理去分化的軟骨細(xì)胞28天。通過(guò)vonKossa染色評(píng)價(jià)成功的分化。E)染色陰性對(duì)照；F)通過(guò)vonKossa染色證明鈣化基質(zhì)的積累；(顯示一個(gè)代表性實(shí)驗(yàn)，n＝6)；線＝50μm。圖2顯示低依附板中的凝聚動(dòng)力學(xué)。特殊處理的培養(yǎng)皿表面用于該3D培養(yǎng)系統(tǒng)，在此細(xì)胞無(wú)法依附。在低依附板中供應(yīng)細(xì)胞懸浮液(106個(gè)細(xì)胞/ml)。在3D培養(yǎng)誘導(dǎo)后細(xì)胞立即開(kāi)始相互作用；(顯示一個(gè)代表性實(shí)驗(yàn)，n＝6)。圖3顯示凝聚階段期間軟骨形成相關(guān)基因的基因表達(dá)動(dòng)力學(xué)。與單層表達(dá)比較，在3D培養(yǎng)誘導(dǎo)后的前90或72小時(shí)內(nèi)的基因表達(dá)的實(shí)時(shí)PCR分析。管家基因比以對(duì)數(shù)標(biāo)度顯示，(n＝6)通過(guò)Mann-WhitneyU_-測(cè)試進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。圖4顯示在低依附培養(yǎng)28天后軟骨形成相關(guān)基因的基因表達(dá)。與單層表達(dá)比較，在3D培養(yǎng)誘導(dǎo)后28天的基因表達(dá)的實(shí)時(shí)PCR分析。管家基因比以對(duì)數(shù)標(biāo)度顯示，(n＝6)通過(guò)Mann-WhitneyU_-測(cè)試進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。圖5顯示差異表達(dá)基因的分類。[A]凝聚階段(24h)和[B]分化階段(28天)的兩個(gè)獨(dú)立微陣列實(shí)驗(yàn)分別的評(píng)價(jià)。根據(jù)Panther基因本體數(shù)據(jù)庫(kù)顯示所選基因本體組中上調(diào)和下調(diào)基因的數(shù)量。圖6顯示PTX處理細(xì)胞的細(xì)胞凝聚。在凝聚過(guò)程中將百日咳毒素(PertussisToxine)以三種不同的濃度給予去分化的軟骨細(xì)胞。在PTX處理后，未觀察到凝聚表現(xiàn)方面的顯著變化(顯示一個(gè)代表性實(shí)驗(yàn)，n＝3)。圖7顯示凝聚過(guò)程中的細(xì)胞相互作用和亞聚集體連接。通過(guò)3D低依附培養(yǎng)誘導(dǎo)的凝聚；網(wǎng)狀連接在培養(yǎng)誘導(dǎo)后12小時(shí)可見(jiàn)；(顯示一個(gè)代表性實(shí)驗(yàn)，n＝6)。圖8顯示本發(fā)明的自我包含式3D體外雙相軟骨-骨類器官在芯片上的裝置的示意圖。圖9顯示3D陶瓷培養(yǎng)系統(tǒng)中MSCs的表現(xiàn)。(A)生態(tài)位ECM組分的免疫組織化學(xué)和2-光子顯微術(shù)，(i)膠原蛋白-I，(ii)纖連蛋白和(iii)整聯(lián)蛋白4a在培養(yǎng)的(a)第1天和(b)第7天之間高度表達(dá)。(標(biāo)度線：100μm)。(B)SEM成像示例(i，iii)3D培養(yǎng)2周后的MSCs與(ii，iv)骨松質(zhì)(標(biāo)度線：10μm)之間的結(jié)構(gòu)相似性。(C)3D培養(yǎng)1周后MSCs的自發(fā)成骨分化，通過(guò)陽(yáng)性VonKossa(i)染色和Alizarin紅(iii)染色可見(jiàn)——與未接種的陶瓷(ii，iv)相比。(D)與單層相比在1和4周后共培養(yǎng)系統(tǒng)中的已知生態(tài)位分子的實(shí)時(shí)PCR分析。(n＝3，誤差線：平均值的SD，***p<0.001)。圖10顯示HSPC存活和表型。(A)HSPCs在接種后在3D共培養(yǎng)系統(tǒng)中存活(i)1周，(ii)2周，(iii)4周和(iv)8周，通過(guò)熒光顯微術(shù)可見(jiàn)。MSC核用DAPI復(fù)染成藍(lán)色。(標(biāo)度線：100μm)。(B)代表性FACS圖和(C，D)定量——3D和傳統(tǒng)共培養(yǎng)系統(tǒng)中原始的(CD34+CD38-)和分化的(CD34+CD38+)HSPCs。(n＝8，誤差線-平均值的SD，**p<0.01，***p<0.001)。圖11顯示HSPC增殖。(A)顯示不同培養(yǎng)系統(tǒng)中HSPCs的差異增殖的CFSE-FACS分析的代表性柱狀圖。虛線描述慢(右側(cè))和快(左側(cè))增殖細(xì)胞部分。(B)四個(gè)培養(yǎng)系統(tǒng)中慢增殖細(xì)胞的定量。(C，D，E)在培養(yǎng)1、2和4周后各培養(yǎng)系統(tǒng)中慢和快增殖細(xì)胞部分的原始(CD34+CD38-)HSPCs的定量。(n＝6，誤差線-平均值的SD，*p<0.05，***p<0.001)。圖12顯示HSPC生活力和功能性。(A)代表性FACS圖和(B，C)定量——3D和傳統(tǒng)共培養(yǎng)系統(tǒng)中的壞死(PI陽(yáng)性)和凋亡(膜聯(lián)蛋白V陽(yáng)性)HSPCs。(n＝8，誤差線-平均值的SD，*p<0.05**p<0.01，***p<0.001)。(D,E)來(lái)自3D共培養(yǎng)系統(tǒng)的HSPCs的多系分化潛能。代表性(i)GEMM，(ii)BFU-E，(iii)GM集落和(E)CFU-GEMM分析后的集落評(píng)分(n＝3)。圖13顯示3D共培養(yǎng)系統(tǒng)中組分的相互作用。(A)在培養(yǎng)2周后3D共培養(yǎng)系統(tǒng)的免疫組織化學(xué)和2-光子顯微術(shù)。顯示當(dāng)與未染色的對(duì)照(i)(標(biāo)度線：100μm)比較時(shí)，綠色追蹤的HSCs和紅色追蹤的MSCs與Alexa350(藍(lán)色)染色的ECM組分(ii)膠原蛋白I和(iii)纖連蛋白，以及與信號(hào)傳導(dǎo)分子(iv)C-Kit(v)整聯(lián)蛋白4a(vi)N鈣粘蛋白共同定位。(B)SEM成像示例在3D培養(yǎng)2周后較小圓形HSPCs和較大扁平附著MSCs之間的物理相互作用(標(biāo)度線：10μm)。實(shí)施例：實(shí)施例A：I.人造骨組織的形成：細(xì)胞通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)程序分離間充質(zhì)干細(xì)胞(MSC)。簡(jiǎn)言之，將骨髓吸出物用PBS仔細(xì)漂洗，并通過(guò)Ficoll密度梯度離心分離PBMC(周圍血液?jiǎn)魏思?xì)胞)。通過(guò)塑料附著然后上至4代的擴(kuò)增期分離間充質(zhì)先祖。利用MACS技術(shù)(MiltenyiBiotec)通過(guò)CD34表達(dá)從臍血樣品分離人造血干細(xì)胞。在補(bǔ)充培養(yǎng)基(的TPO,FLT3,IL6和SCF)中培養(yǎng)HSC。平臺(tái)通過(guò)3D陶瓷支架(Zellwerk)提供人造骨髓的平臺(tái)。為誘導(dǎo)協(xié)調(diào)的增殖、分化和根據(jù)胞外基質(zhì)沉積的微環(huán)境和信號(hào)傳導(dǎo)分子表達(dá)的再調(diào)節(jié)，在添加造血干細(xì)胞前一周將間充質(zhì)干細(xì)胞接種在該陶瓷上。然后將陶瓷在靜態(tài)培養(yǎng)中或在連續(xù)營(yíng)養(yǎng)物供應(yīng)的灌注系統(tǒng)中進(jìn)一步培養(yǎng)。通過(guò)基因表達(dá)分析、通過(guò)FACS技術(shù)的不同細(xì)胞群組成和一般生物學(xué)功能(HSC保持和增殖、個(gè)體干細(xì)胞生態(tài)位發(fā)育、免疫學(xué)問(wèn)題)的確定，評(píng)價(jià)骨髓的功能。II.軟骨形成細(xì)胞聚集體或人造軟骨組織的形成：骨關(guān)節(jié)炎和類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎是影響軟骨結(jié)構(gòu)的退行性疾病。由不同因素(例如，機(jī)械過(guò)載、年齡、損傷和炎癥)引起，組織結(jié)構(gòu)被不可逆地?fù)p失，因?yàn)檐浌莾?nèi)的細(xì)胞僅具有非常低的固有自我修復(fù)能力。因此，為找到誘導(dǎo)軟骨再生過(guò)程的替代性策略，近幾十年已做出多種嘗試。近些年，自體細(xì)胞在再生藥物中的應(yīng)用是深入研究的主題。但是，仍要建立間充質(zhì)祖細(xì)胞的理想來(lái)源和體外分化的最佳培養(yǎng)條件。間充質(zhì)基質(zhì)/干細(xì)胞由于其分化成所有間充質(zhì)組織的能力脫穎而出，雖然可得自骨髓或其他組織來(lái)源的細(xì)胞數(shù)量是受限的。因此，自健康組織分離然后擴(kuò)增的自體細(xì)胞的應(yīng)用是解決這種困難的一項(xiàng)有希望的策略。不幸地，細(xì)胞在撤銷其正常組織微環(huán)境后失去其分化表型。因此，通過(guò)酶消化和隨后的二維單層培養(yǎng)使軟骨細(xì)胞自其正常三維關(guān)節(jié)軟骨基質(zhì)分離導(dǎo)致細(xì)胞改變，在此過(guò)程中細(xì)胞重新進(jìn)入細(xì)胞周期，失去其圓形表型，并將其基質(zhì)分子生產(chǎn)從膠原蛋白II、IX和XI型切換成I、III和V型。另外，已證明，2D-培養(yǎng)的軟骨細(xì)胞表達(dá)間充質(zhì)干細(xì)胞表面標(biāo)記并且具有多系分化潛能。該過(guò)程被稱為去分化，并突出了完整3D環(huán)境對(duì)于保持軟骨細(xì)胞表型的重要性。因此，近年來(lái)，顯現(xiàn)發(fā)育過(guò)程不僅由可溶性因子控制，而且另外還由附著分子提供的空間排列控制，其不僅介導(dǎo)細(xì)胞-細(xì)胞和細(xì)胞-基質(zhì)相互作用，還有助于通過(guò)附著信號(hào)傳導(dǎo)進(jìn)行的基因表達(dá)調(diào)節(jié)。因此，在3D結(jié)構(gòu)中培養(yǎng)祖細(xì)胞呈現(xiàn)為體外軟骨形成性再分化過(guò)程中的關(guān)鍵刺激因素之一。因此，多種3D培養(yǎng)系統(tǒng)已因此被建立。常用四種在3D系統(tǒng)中培養(yǎng)間充質(zhì)細(xì)胞或祖細(xì)胞的技術(shù)：1)水凝膠封裝、2)微團(tuán)培養(yǎng)、3)高密度細(xì)胞團(tuán)塊和4)生物相容性支架。在3D微環(huán)境中培養(yǎng)和防止單層形成是所有所述培養(yǎng)系統(tǒng)的原理。盡管事實(shí)上所有培養(yǎng)模型均能夠誘導(dǎo)軟骨形成分化——通過(guò)膠原蛋白II型和蛋白多糖的上調(diào)證明，但仍存在顯著缺陷。細(xì)胞由于離心(團(tuán)塊培養(yǎng))或通過(guò)重力(微團(tuán))被強(qiáng)制形成細(xì)胞3D聚集體。另一方面，在生物相容性支架上水凝膠封裝或培養(yǎng)后，細(xì)胞相互作用的能力受限，或成不可能。但是，體外模擬軟骨細(xì)胞分化的完整體內(nèi)過(guò)程，以獲得再生應(yīng)用的最佳先決條件，以及提供模型培養(yǎng)系統(tǒng)，以擴(kuò)展該多步過(guò)程的充分了解，似乎是合理的。間充質(zhì)凝聚代表骨骼成分發(fā)育的第一步，其中先祖遷移至未來(lái)骨骼形成的位點(diǎn)，并開(kāi)始積累和凝聚，生成高密度細(xì)胞聚集體。在體外再分化的過(guò)程中，主要目標(biāo)是整合該第一步——聚集體形成。不幸地，沒(méi)有常用3D培養(yǎng)系統(tǒng)適于這種目的，因?yàn)槠淙咳狈υ谀圻^(guò)程前獨(dú)立單細(xì)胞移動(dòng)性的先決條件。發(fā)明人已建立了無(wú)支架培養(yǎng)系統(tǒng)，其包括分離的去分化軟骨細(xì)胞的初始細(xì)胞凝聚和隨后軟骨形成再分化。凝聚過(guò)程以及再分化細(xì)胞的集中特征在于綜合基因表達(dá)分析。由于軟骨形成分化通過(guò)膠原蛋白II型表達(dá)的劇烈上調(diào)和蛋白多糖的大量分泌和積累來(lái)證明，這種新的3D培養(yǎng)系統(tǒng)首次提供研究體外間充質(zhì)凝聚刺激過(guò)程的機(jī)會(huì)。細(xì)胞聚集期間趨化因子信號(hào)傳導(dǎo)的抑制證明，凝聚過(guò)程與細(xì)胞遷移無(wú)關(guān)，但由附著分子和增強(qiáng)的細(xì)胞-細(xì)胞接觸介導(dǎo)。材料和方法原代軟骨細(xì)胞的分離和培養(yǎng)來(lái)自志愿者供體的關(guān)節(jié)膝軟骨得自MusculoskeletalResearchCenterBerlin，Charité(Berlin，德國(guó))以及得自InstituteofExperimantalPathologyCharité，CampusVirchow。研究經(jīng)當(dāng)?shù)貍惱砦瘑T會(huì)(CharitéCampusMitte，UniversityHospitalBerlin)批準(zhǔn)。將軟骨組織切成小塊，并通過(guò)利用DMEM中的膠原蛋白酶(1mg/ml，Sigma-Aldrich)在37℃下酶消化過(guò)夜釋放軟骨細(xì)胞。通過(guò)70μm尼龍細(xì)胞染色器(BDFalconTM，Belgium)過(guò)濾，將細(xì)胞從消化的組織分離，用PBS洗滌，并在包含10％FCS的DMEM中培養(yǎng)。將原代軟骨細(xì)胞在帶有加濕氣氛(5％CO2/空氣)的水套式培育箱中、在37℃下、在補(bǔ)充10％FCS和青霉素/鏈霉素(Gibco)的DMEM培養(yǎng)基(Gibco)中培養(yǎng)。將細(xì)胞傳代至少10次，以生成完全的去分化表型。去分化軟骨細(xì)胞的表征通過(guò)FACS的表面表達(dá)分析。通過(guò)直接免疫熒光染色分析去分化軟骨細(xì)胞的不同間充質(zhì)干細(xì)胞(MSC)表面標(biāo)記分子的表達(dá)。通過(guò)胰蛋白酶消化和離心收集細(xì)胞，并將細(xì)胞團(tuán)塊重懸浮于PBS/BSA(0.5％)中。用熒光標(biāo)記的抗體在RT下培育細(xì)胞15min。作為同種型對(duì)照，將細(xì)胞用與MSC抗體相同的同種型的T-細(xì)胞標(biāo)記分子染色。然后將染色分析用PBS/BSA洗滌，并離心去除未結(jié)合的抗體。將細(xì)胞團(tuán)塊重懸浮于400μlPBS/BSA中，并在FACSCaliburTM(BDBiosciences)上進(jìn)行分析。對(duì)于死亡細(xì)胞的檢測(cè)，在流式細(xì)胞術(shù)分析前即刻添加碘化丙啶(propidiumjodid)。獲得并利用CellQuestTM軟件分析30,000個(gè)事件。分化潛能。利用已知培養(yǎng)基補(bǔ)充(DMEM，帶有10％FCS、10μg/ml胰島素、0,2mM吲哚美辛(Indomethacin)、1μM地塞米松(Dexamethasone)、0,5mM3-異丁基-甲基-黃嘌呤(Sigma))，在2D培養(yǎng)中誘導(dǎo)脂肪形成性分化。將去分化的軟骨細(xì)胞接種在6孔板(Corning-100.000個(gè)細(xì)胞每孔)中，并在DMEM+10％FCS中培養(yǎng)到細(xì)胞匯合。刺激細(xì)胞28天，其中每4天更換培養(yǎng)基。脂類油紅O染色：在28d后將細(xì)胞在4％多聚甲醛中固定10min，用PBS洗滌，隨后用新過(guò)濾的油紅O染色溶液(0,7％在丙烯甘油中)(Sigma)培育1h。在用蒸餾水漂洗細(xì)胞兩次后，通過(guò)光學(xué)顯微鏡術(shù)評(píng)價(jià)染色。利用適當(dāng)?shù)姆只囵B(yǎng)基(DMEM+10％FCS、10mMβ-磷酸甘油(Sigma)、10nM地塞米松(Sigma)、0,1mML抗壞血酸2-磷酸酯(Sigma)，在單層培養(yǎng)中誘導(dǎo)成骨分化。簡(jiǎn)言之，將細(xì)胞接種在6孔板(Corning-100.000個(gè)細(xì)胞每孔)中，并在DMEM+10％FCS中培養(yǎng)到細(xì)胞達(dá)到匯合。每4天更換培養(yǎng)基，并在成骨刺激21天后，通過(guò)分泌的Ca2+基礦物化基質(zhì)的vonKossa染色作為成骨細(xì)胞分化的標(biāo)記，將細(xì)胞染色。用4％多聚甲醛(Sigma)固定細(xì)胞。將硝酸銀溶液(5％，Sigma)給予固定的細(xì)胞，并將培養(yǎng)板置于UV光中20min。最終，將細(xì)胞用水漂洗，并通過(guò)光學(xué)顯微鏡術(shù)進(jìn)行評(píng)價(jià)。3D培養(yǎng)系統(tǒng)對(duì)于3D低依附培養(yǎng)，收集去分化的軟骨細(xì)胞，并將其重懸浮于DMEM+10％FCS中，以在單個(gè)細(xì)胞懸浮液中生成106個(gè)細(xì)胞/ml。將細(xì)胞懸浮液(1ml每孔)給予24孔低依附板(UltraLowClusterPlate，Corning，德國(guó))。與標(biāo)準(zhǔn)組織培養(yǎng)皿的帶負(fù)電親水性表面相反，超低依附板具有中性的、親水水凝膠涂布的表面，其很大程度上最小化依附蛋白質(zhì)的結(jié)合。通過(guò)利用這種特殊培養(yǎng)皿，細(xì)胞不會(huì)如同微團(tuán)培養(yǎng)通過(guò)細(xì)胞附著在低聚層構(gòu)建物中沉降。防止2D單層培養(yǎng)物的形成，并且細(xì)胞在此懸浮培養(yǎng)保持條件下保持圓形。此外，與其中細(xì)胞通過(guò)離心被強(qiáng)制沉降的團(tuán)塊培養(yǎng)系統(tǒng)相反，低依附培養(yǎng)系統(tǒng)提供在初始凝聚過(guò)程中自由細(xì)胞運(yùn)動(dòng)和細(xì)胞細(xì)胞相互作用的機(jī)會(huì)。為確保恒定培養(yǎng)條件，每3天定期更換培養(yǎng)基。為干擾低依附培養(yǎng)中G-蛋白結(jié)合受體引起的趨化信號(hào)傳導(dǎo)，將百日咳毒素(Sigma，德國(guó))以不同的濃度(10、100和1000ng/ml)給予在低依附凝聚實(shí)驗(yàn)中的培養(yǎng)基。組織學(xué)將收集的聚集體的部分在低溫恒溫器中切成5-μm厚，并安置于SuperfrostPlus玻片(Menzel)上。將玻片干燥和固定。蘇木精染色。將切片在蘇木精染色溶液(Sigma)中溫育3min，隨后在自來(lái)水中漂洗。將切片脫水和安置。通過(guò)光學(xué)顯微鏡術(shù)分析染色切片。阿爾新藍(lán)染色。將玻片在3％酸性酸中預(yù)溫育3min，然后在室溫下用阿爾新藍(lán)(Sigma)(3％，在3％乙酸中)溶液處理30min。將切片用水洗滌，脫水和安置。通過(guò)光學(xué)顯微鏡術(shù)分析染色切片。II型膠原蛋白染色。將玻片用蛋白質(zhì)阻斷劑(block)(DakoCytomation)在RT下處理10min，然后用抗2A型膠原蛋白的一級(jí)單克隆抗體(BDBiosciences)在4℃下溫育過(guò)夜。第二天，將切片用Cy3結(jié)合的二級(jí)抗體(DakoCytomation)溫育1h，并將核通過(guò)DAPI復(fù)染。通過(guò)熒光顯微術(shù)分析染色切片。實(shí)時(shí)PCR。在所示時(shí)間點(diǎn)溶解細(xì)胞，利用RNAII試劑盒(Machery和Nagel)提取RNA。通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄400ng總RNA(Taqman，Roche)合成cDNA。利用下列條件進(jìn)行實(shí)時(shí)PCR實(shí)驗(yàn)：1μlcDNA，各0.5μM引物，6mMMgCl2，200mMdNTP，50mMTris(pH8.8)，500ng/mlBSA，Immolase0.05U/ml(Bioline)，1×Sybrgreen(MolecularProbes)。表達(dá)相對(duì)水平以與GAPDH表達(dá)的比給出。DNA微陣列分析。根據(jù)生產(chǎn)協(xié)議利用人基因組CGH微陣列44K(Agilent)。微陣列實(shí)驗(yàn)基于雙色比雜交和低RNA輸入熒光線性擴(kuò)增試劑盒(Agilent)進(jìn)行RNA標(biāo)記。簡(jiǎn)言之，將500ng總RNA用低聚(dT)-T7啟動(dòng)子引物和Moloney鼠白血病病毒-逆轉(zhuǎn)錄酶(MMLV-RT)逆轉(zhuǎn)錄，以合成cDNA的第一鏈和第二鏈。用同時(shí)包括花青3-胞苷5'-三磷酸酯(3-CTP)或花青5-CTP的T7RNA聚合酶合成熒光反義cRNA。通過(guò)花青3-CTP的A552nm的吸光度和花青5-CTP的A650nm的吸光度定量純化產(chǎn)物，并用Nanodrop光度計(jì)(Kisker)驗(yàn)證標(biāo)記效力。在雜交前，將2μg各標(biāo)記的cRNA產(chǎn)物片段化，并根據(jù)供應(yīng)商協(xié)議(Agilent)與對(duì)照靶標(biāo)和雜交緩沖液混合。雜交在60℃下進(jìn)行過(guò)夜。然后洗滌玻片，并利用DNA微陣列激光掃描儀(Agilent)以5-μm分辨率進(jìn)行微陣列掃描。利用采用默認(rèn)設(shè)置的圖像分析工具A6.1.1版(Agilent)提取特征。在RosettaInformaticsPlatformResolverBuilt4.0上進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。通過(guò)嚴(yán)格的數(shù)據(jù)評(píng)價(jià)和2-倍表達(dá)截?cái)嘟Y(jié)合僅選擇低p值(p<0.05)數(shù)據(jù)點(diǎn)的要求，鑒定表達(dá)圖譜的變化。通過(guò)應(yīng)用此策略，數(shù)據(jù)評(píng)價(jià)獨(dú)立于RosettaResolver系統(tǒng)(Agilent)中實(shí)施的誤差模型。結(jié)果為實(shí)現(xiàn)完全表型去分化，將分離的軟骨細(xì)胞以單層培養(yǎng)至少10代。如前所述，細(xì)胞采用明確的先祖表型，該先祖表型由如下標(biāo)記：MSC表面標(biāo)記(CD105、CD106、CD44、CD73、CD90和CD13)和多分化潛能(脂肪細(xì)胞和骨細(xì)胞)(圖1)(Rosowski等，2006)的表達(dá)。根據(jù)表面表達(dá)，觀察到均一的去分化軟骨細(xì)胞群。低依附培養(yǎng)后的細(xì)胞凝聚這種培養(yǎng)技術(shù)的基本思路是避免細(xì)胞依附于培養(yǎng)皿表面和保持細(xì)胞移動(dòng)性。為防止依附單層形成，將培養(yǎng)細(xì)胞接種于具有特殊處理的表面的低依附板的孔中。在數(shù)小時(shí)內(nèi)，細(xì)胞開(kāi)始相互附著，生成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。在接下來(lái)的72小時(shí)過(guò)程中，帶孔結(jié)構(gòu)凝聚，并最終在每孔生成一個(gè)高密度細(xì)胞聚集體，其平均直徑為1-2毫米(圖2)。將細(xì)胞聚集體再培養(yǎng)4周，而尺寸或形狀無(wú)任何明顯變化。將培養(yǎng)過(guò)程細(xì)分為早期和晚期階段，并分別評(píng)價(jià)。體外間充質(zhì)凝聚–早期事件在第一步中，分析軟骨形成分化的基因特征的表達(dá)(圖3)。轉(zhuǎn)錄因子SOX-5的mRNA水平在培養(yǎng)12小時(shí)后略微上調(diào)。在較晚時(shí)間點(diǎn)時(shí)，表達(dá)回落至單層水平。驚人地發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子SOX-9與單層培養(yǎng)相比下調(diào)3倍。這種減少的mRNA水平在凝聚形成的前三天內(nèi)保持。然而，兩種轉(zhuǎn)錄因子在單層和低依附培養(yǎng)中均高度表達(dá)，其由GAPDH比指示。去分化的軟骨細(xì)胞顯示不同的TGF-β1表達(dá)；但是，這種生長(zhǎng)因子在細(xì)胞凝聚中保持不變。如預(yù)期的，低依附凝聚中的N-鈣粘蛋白表達(dá)在凝聚前幾個(gè)小時(shí)內(nèi)顯著上調(diào)。在較晚時(shí)間點(diǎn)，當(dāng)凝聚物已形成時(shí)，檢測(cè)到附著分子的基因表達(dá)減少4倍。驚人地，甚至在3D培養(yǎng)的初始階段也測(cè)量到所選基質(zhì)分子的mRNA水平的顯著變化。發(fā)現(xiàn)單層培養(yǎng)中1A1型膠原蛋白大量表達(dá)，但該分子在3D培養(yǎng)誘導(dǎo)后4小時(shí)下調(diào)10倍，并顯示在接下來(lái)的90小時(shí)內(nèi)進(jìn)一步逐步減少。相反，發(fā)現(xiàn)軟骨基質(zhì)分子2A1型膠原蛋白在低依附培養(yǎng)90小時(shí)后被誘導(dǎo)12倍。但是，蛋白多糖組分聚集蛋白聚糖(Aggrecan)的mRNA水平在很早期時(shí)間點(diǎn)(4小時(shí))顯著降低10倍，并在3D培養(yǎng)接下來(lái)的4天內(nèi)進(jìn)一步降低(圖3)。軟骨形成分化–晚期事件為分析低依附3D培養(yǎng)系統(tǒng)的軟骨形成潛能，限定具體胞外基質(zhì)組分的積累(圖4)。此外，通過(guò)實(shí)時(shí)PCR定量軟骨形成相關(guān)基因的表達(dá)(圖4)。在28天后，將聚集體切片，用于組織學(xué)分析。聚集體切片的蘇木精染色證實(shí)高細(xì)胞密度。此外，通過(guò)阿爾新藍(lán)染色可觀察胞外基質(zhì)蛋白多糖的大量積累。在3D培養(yǎng)4周后2A1型膠原蛋白表達(dá)增加3個(gè)數(shù)量級(jí)，是確定的基質(zhì)分子的最突出結(jié)果。2A1型膠原蛋白表達(dá)的動(dòng)力學(xué)免疫組織學(xué)分析證實(shí)2A1型膠原蛋白的積累，甚至在3D培養(yǎng)初始階段期間。在培養(yǎng)誘導(dǎo)后的前兩天內(nèi)，未檢測(cè)到2A1膠原蛋白信號(hào)。但是，在細(xì)胞凝聚誘導(dǎo)后8天證實(shí)了顯著信號(hào)，和在培養(yǎng)4周后，證實(shí)了甚至更廣泛的2A1型膠原蛋白沉積。此外，與單層培養(yǎng)相比，證實(shí)1A1型膠原蛋白表達(dá)減少——mRNA水平減少25倍。意外地，聚集蛋白聚糖mRNA水平與增殖2D培養(yǎng)相比減少5倍(圖4)。驚人地，轉(zhuǎn)錄因子Sox-9呈現(xiàn)在增殖單層細(xì)胞中異常高水平的基因表達(dá)——通過(guò)GAPDH比指示。在聚集體形成期間表達(dá)暫時(shí)減少后，mRNA水平返回單層基礎(chǔ)值。另一方面，可檢測(cè)到Sox-5表達(dá)進(jìn)一步增加14倍。因此，Sox-5相對(duì)表達(dá)在低依附培養(yǎng)4周后超過(guò)相對(duì)Sox-9表達(dá)。此外，可確定在3D培養(yǎng)中TGFβ1和附著分子N-鈣粘蛋白的mRNA水平的進(jìn)一步增加(圖4)。綜合分析凝聚和分化過(guò)程為應(yīng)用無(wú)支架分化系統(tǒng)，利用基因組范圍的微陣列分析進(jìn)一步研究細(xì)胞分化以及表征凝聚過(guò)程中表達(dá)圖譜的變化。進(jìn)行兩個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)——利用各自的原代細(xì)胞培養(yǎng)。將熒光標(biāo)記的探針雜交在Agilent44KDNA芯片上。將兩芯片的所得數(shù)據(jù)合并以進(jìn)行評(píng)價(jià)。如果兩陣列證明基因表達(dá)至少2倍變化，則基因被命名為被調(diào)控基因。p值截?cái)啾活A(yù)先指定為p<0.05。為獲得該具體研究的生物學(xué)過(guò)程的總體思路，根據(jù)PantherGO分類將被調(diào)控基因分組(表1-5)。在早期和晚期階段均具有最高數(shù)量的被調(diào)控基因的組是細(xì)胞-細(xì)胞通信，發(fā)育過(guò)程和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)(圖5)，表明誘導(dǎo)分化過(guò)程所需的功能組的基因表達(dá)被大幅調(diào)節(jié)。但是，3D培養(yǎng)系統(tǒng)的目的是去分化軟骨細(xì)胞的再分化。因此，更詳細(xì)地探尋Panther分類”骨骼系統(tǒng)發(fā)育。凝聚階段。如表1和2顯示，生長(zhǎng)因子TGF-β3和GDF-15以及轉(zhuǎn)錄因子Fos是此分組中的最高上調(diào)基因。顯著地，Hox-A簇的數(shù)個(gè)成員表達(dá)被定義為在凝聚階段中升高。TGF-β組成員Inhibin-_B代表最強(qiáng)下調(diào)基因，并且在培養(yǎng)28天后抑制也很明顯和。28天后的聚集體(表3和4)。在28天后最突出的上調(diào)基因是軟骨相關(guān)基質(zhì)分子膠原蛋白II、IX和XI?；|(zhì)Gla-蛋白和軟骨酸性蛋白也顯示mRNA水平增加，而意外但與實(shí)時(shí)PCR數(shù)據(jù)一致的是，聚集蛋白聚糖和聚集蛋白聚糖合成酶HAS呈現(xiàn)被下調(diào)。在此分組中的最高上調(diào)基因是轉(zhuǎn)錄因子Fos和Runx2以及生長(zhǎng)因子GDF-15，而非軟骨基質(zhì)分子膠原蛋白I和XII急劇減少。凝聚過(guò)程由細(xì)胞-細(xì)胞附著介導(dǎo)間充質(zhì)凝聚過(guò)程的特征在于松散間充質(zhì)的聚集。然而，關(guān)于如何介導(dǎo)這種祖細(xì)胞密度增加所知甚少。由于Panther分類中的幾個(gè)蛋白質(zhì)家族的多功能性，根據(jù)KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)將附著分子和趨化分子以較窄意義細(xì)分。由于DNA微陣列數(shù)據(jù)證明了差異表達(dá)的趨化因子和相應(yīng)的受體(表5)，應(yīng)用這種3D培養(yǎng)系統(tǒng)的第一個(gè)嘗試，應(yīng)分析凝聚過(guò)程中趨化因子和遷移性細(xì)胞活性的潛在參與。大部分趨化因子受體是七種跨膜受體家族的部分。這類蛋白質(zhì)通過(guò)G-蛋白關(guān)聯(lián)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)發(fā)出其信號(hào)傳導(dǎo)。百日咳毒素(PTX，百日咳博德特氏菌(Bordetellapertussis))通過(guò)G亞單元——異三聚G蛋白復(fù)合體——的ADP-核糖基化擾亂該途徑。為在凝聚期間消除趨化因子活性，通過(guò)添加不同濃度的PTX進(jìn)行低依附培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)。意外地，在前72小時(shí)內(nèi)，PTX處理的培養(yǎng)的細(xì)胞凝聚呈現(xiàn)出與對(duì)照實(shí)驗(yàn)無(wú)差別，而與施加的濃度無(wú)關(guān)(圖6)。在培養(yǎng)誘導(dǎo)后即刻，細(xì)胞形成小細(xì)胞簇，通過(guò)網(wǎng)狀過(guò)渡階段進(jìn)一步變稠，直到最終形成一個(gè)高密度細(xì)胞聚集體，而與PTX給予無(wú)關(guān)，并且具有相似動(dòng)力學(xué)。該觀察結(jié)果顯示，細(xì)胞聚集過(guò)程不涉及趨化因子介導(dǎo)的細(xì)胞遷移。有意思的是，微陣列評(píng)價(jià)結(jié)果證明，75％的差異表達(dá)的附著分子呈現(xiàn)被上調(diào)，這表明凝聚步驟期間細(xì)胞間相互作用增加(表5)。該假設(shè)通過(guò)更詳細(xì)的顯微術(shù)觀察被確認(rèn)。在多個(gè)亞聚集體出現(xiàn)的不同過(guò)渡階段，長(zhǎng)枝狀細(xì)胞產(chǎn)物變得可見(jiàn)。連接直接從一個(gè)至下一個(gè)細(xì)胞亞中心形成(圖7A-C)或通過(guò)具有相反方向的兩個(gè)延伸的單個(gè)細(xì)胞建立(圖7D)。在晚期階段，利用這些細(xì)串將全部亞聚集體連接成最終聚集體。因此，凝聚過(guò)程通過(guò)附著分子表達(dá)增加被驅(qū)動(dòng)，導(dǎo)致相對(duì)于趨化因子介導(dǎo)的細(xì)胞遷移，細(xì)胞相互作用增加?？偨Y(jié)自體祖細(xì)胞的應(yīng)用代表恢復(fù)骨關(guān)節(jié)炎中破壞的軟骨組織的有希望的策略。這些細(xì)胞可被觸發(fā)進(jìn)行分化，成為功能活性軟骨細(xì)胞，生成新合成的軟骨。到目前為止，為此已建立數(shù)種培養(yǎng)系統(tǒng)。由于軟骨形成分化起始于體內(nèi)間充質(zhì)凝聚步驟，對(duì)于完全表征體外第一譜系特異性步驟具有極大意義。因此，研發(fā)無(wú)支架低依附3D培養(yǎng)系統(tǒng)，模擬包括初始凝聚階段的整個(gè)軟骨形成過(guò)程。培養(yǎng)系統(tǒng)能夠誘導(dǎo)軟骨形成分化，該軟骨形成分化由關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子Sox-5和II和IX型膠原蛋白的基因表達(dá)增加來(lái)指示。與其他已建立的3D培養(yǎng)系統(tǒng)相比，低依附板培養(yǎng)的應(yīng)用提供了如下優(yōu)勢(shì)：分析從此前分離和擴(kuò)張的間充質(zhì)源的人原代細(xì)胞的單獨(dú)細(xì)胞懸浮液開(kāi)始的細(xì)胞聚集的不同階段。早期階段的分析證明，凝聚過(guò)程由增加的細(xì)胞-細(xì)胞附著介導(dǎo)，而非由趨化因子信號(hào)傳導(dǎo)介導(dǎo)。因此，低依附3D培養(yǎng)系統(tǒng)可最終有助于鑒定對(duì)于體內(nèi)軟骨形成分化誘導(dǎo)或用于臨床應(yīng)用的體外生成移植物至關(guān)重要的關(guān)鍵因子。III.自我包含式3D體外雙相軟骨-骨類器官在芯片上的裝置：在圖8中，描述本發(fā)明的自我包含式3D體外雙相軟骨-骨類器官在芯片上的裝置。自我包含式3D體外雙相軟骨-骨類器官在芯片上的裝置1包括基底2，其中形成兩個(gè)培養(yǎng)基供給儲(chǔ)器5，其通過(guò)培養(yǎng)基供給通道6相互連接。自我包含式3D體外雙相軟骨-骨類器官在芯片上的裝置1進(jìn)一步包括器官腔7，其中容納3D體外雙相軟骨-骨類器官，該3D體外雙相軟骨-骨類器官包括人造軟骨組織層4和人造骨組織層3，其中人造軟骨組織4直接接觸人造骨組織3的表面。為允許在3D體外雙相軟骨-骨類器官上施加機(jī)械力，可存在致動(dòng)器8。實(shí)施例B：材料和方法1.MSCs的分離和擴(kuò)張?jiān)诰哂邪凑誆thicsboardoftheCharite-UniversitatsmedizinBerlin指南的書面同意的情況下，人MSCs分離自在關(guān)節(jié)置換手術(shù)后獲得的股骨頭骨髓，如前所述。然后細(xì)胞在Dulbecco改良的Eagle培養(yǎng)基(DMEM)中擴(kuò)張，該培養(yǎng)基具有4.5g/l葡萄糖(PAALaboratories，Austria)，包含10％FBS(PAALaboratories，Austria)和青霉素-鏈霉素(PAAlaboratories)。4和7代之間的MSCs用于共培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)。2.HSPCs的分離在具有按照EthicsboardoftheCharite-UniversitatsmedizinBerlin指南的書面同意的情況下，人HSPCs分離自臍帶血。臍帶血被收集在PBS-BSA-EDTA溶液中，并且單核細(xì)胞通過(guò)密度梯度離心被分離。然后利用MACSCD34+分離試劑盒(MiltenyiBiotec，德國(guó))并按照生產(chǎn)商的指示，通過(guò)免疫磁性分離來(lái)分離HSPCs。然后新分離的細(xì)胞以2×104細(xì)胞/培養(yǎng)的密度被導(dǎo)入不同培養(yǎng)系統(tǒng)。3.陶瓷1mm厚并且1cm直徑的基于氧化鋯的、羥磷灰石涂布的Sponceram陶瓷盤購(gòu)自Zellwerkgmbh，德國(guó)。該盤在使用前經(jīng)熱壓處理。4.細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)在接種HSCs前7天，將陶瓷盤接種約106個(gè)細(xì)胞/盤密度的MSCs。陶瓷盤浸入超低依附24孔板(Corninginc.，USA)中的DMEM-高葡萄糖(PAALaboratories，Austria)，其包含10％FBS(PAALaboratories，Austria)和青霉素-鏈霉素。板保持在37℃，5％CO2下。每48小時(shí)更換培養(yǎng)基。同時(shí)，將6孔板也接種MSCs，使得其在24小時(shí)內(nèi)實(shí)現(xiàn)匯合。將這些板中的一組用與陶瓷相同的培養(yǎng)基培養(yǎng)，而另一組用包含地塞米松、抗壞血酸和β-磷酸甘油(Sigma，USA)的骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基處理。在接種MSCs后7天，將新分離的HSPCs導(dǎo)入4種培養(yǎng)條件中：1.3D共培養(yǎng)，其中MSCs接種在陶瓷中；2.2D共培養(yǎng)，其中MSC單層接種在6孔板中；3.2D共培養(yǎng)，其中骨誘導(dǎo)MSC單層接種在6孔板中；和4.在補(bǔ)充有100ng/mlIL-6、SCF、TPO和FLT-3L(Peprotech，UK)的Stemspan培養(yǎng)基(StemcellTechnologiesinc.，Canada)中懸浮培養(yǎng)。9個(gè)獨(dú)立的MSC和HSC樣品用于此研究。在培養(yǎng)開(kāi)始后1、2和4周通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)和免疫組織化學(xué)分析來(lái)自各培養(yǎng)系統(tǒng)的細(xì)胞。分析另外的時(shí)間點(diǎn)——8周——的3D培養(yǎng)，以確定長(zhǎng)時(shí)間培養(yǎng)潛能。5.RNA分離、cDNA制備和qPCR按照提供的指示，利用RNAII試劑盒(Macherey-Nagel，德國(guó))進(jìn)行RNA分離。將在陶瓷中培養(yǎng)的細(xì)胞直接在陶瓷上溶解。按照生產(chǎn)商的指示，通過(guò)利用逆轉(zhuǎn)錄試劑cDNA試劑盒(AppliedBiosystems，USA)進(jìn)行mRNA逆轉(zhuǎn)錄。在96-孔PCR板(BiozymScientific，德國(guó))中利用1μlcDNA與1μl引物混合物和SensiFASTTMSybrNo-ROX試劑盒(Bioline，德國(guó))進(jìn)行實(shí)時(shí)PCR，并利用StratageneMX3005PTMMultiplexQuantitativePCR系統(tǒng)(AgilentTechnologies，USA)讀取。引物購(gòu)自TIBMolBiol(德國(guó))。6.細(xì)胞追蹤為通過(guò)熒光顯微術(shù)長(zhǎng)期追蹤HSPCs和MSCs，在培養(yǎng)前按照生產(chǎn)商的指示分別用525細(xì)胞標(biāo)記試劑盒和細(xì)胞TrackerTMRedCMTPX(Invitrogen，USA)標(biāo)記細(xì)胞。為追蹤細(xì)胞分裂，在分離后即刻按照生產(chǎn)商的指示用2.5μΜ濃度的羧基熒光素二乙酸琥珀酰亞胺酯(CFSE，Invitrogen，USA)標(biāo)記HSPCs。然后門控出(gatedout)綠色標(biāo)記的細(xì)胞，并利用流式細(xì)胞術(shù)在1、2和4周后追蹤細(xì)胞分裂。7.免疫組織化學(xué)為可視化陶瓷支架中的ECM和信號(hào)傳導(dǎo)分子，在接種被追蹤的HSPCs后2周，將具有細(xì)胞的陶瓷固定在-20℃的丙酮(Sigma，USA)中。然后用手術(shù)刀將盤切割，并以150μΙ總體積在96孔板中用膠原蛋白I(鼠抗人，Sigma，USA)，C-Kit(鼠抗人，SantaCruzBiotechnologyInc，USA)，纖連蛋白(鼠抗人，Millipore，USA)，整聯(lián)蛋白4a(鼠抗人，Abeam，UK)和N-鈣粘蛋白(鼠抗人，SantaCruzBiotechnologyInc，USA)的一級(jí)抗體染色。然后將樣品用結(jié)合Alexa350或Alexa594(Invitrogen，USA)的山羊抗鼠二級(jí)抗體染色，洗滌，并通過(guò)顯微鏡檢查可視化。8.熒光和2-光子顯微術(shù)1、2、4和8周后共培養(yǎng)系統(tǒng)中綠色追蹤的HSPCs的存在通過(guò)在用DAPI(Sigma，US)復(fù)染核后，將其在數(shù)字熒光顯微鏡(BZ9000，Keyence，德國(guó))下可視化而確定。ECM和信號(hào)傳導(dǎo)分子利用2光子顯微鏡(TrimscopeII，LaVisionBioTec，德國(guó))被可視化為3D堆疊，并利用Imaris7.5版(BitplaneScientificSoftware，Switzerland)渲染。9.掃描電子顯微鏡(SEM)SEM用于可視化細(xì)胞接種的陶瓷培養(yǎng)系統(tǒng)和骨髓之間的結(jié)構(gòu)相似性以及對(duì)HSPCs和MSCs的物理相互作用。將在共培養(yǎng)2周后帶有MSCs和HSPCs的陶瓷盤和從股骨頭切除的1cm2骨髓片固定，用丙酮脫水，并通過(guò)臨界點(diǎn)干燥而制備。然后將這些樣品涂布以金和銀，并利用HitachiS-520SEM(Hitachi，Japan)可視化。10.流式細(xì)胞術(shù)通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)分析，在表面標(biāo)記表達(dá)的基礎(chǔ)上，比較來(lái)自全部培養(yǎng)系統(tǒng)的HSPCs的表型。通過(guò)在溫育箱中在37℃下用1×胰蛋白酶-EDTA(PAALaboratories，Austria)溫育30分鐘，收集來(lái)自全部附著培養(yǎng)系統(tǒng)的細(xì)胞。將懸浮液細(xì)胞簡(jiǎn)單移送到收集管中。然后按照生產(chǎn)商的指示將細(xì)胞用下列抗體染色：CD34-APC(MiltenyiBiotec，德國(guó))、CD38-PE(USA)、膜聯(lián)蛋白V-PacificBlue(BioLegend，USA)、碘化丙啶(Sigma，USA)。利用Analyzer(Miltenyi，德國(guó))流式細(xì)胞儀進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)分析，并利用FlowJoSoftware，7.6.5版(TreeStarinc.，USA)分析數(shù)據(jù)。11.CFU-GEMM分析利用集落形成單元——粒細(xì)胞、紅細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、巨核細(xì)胞分析，測(cè)試得自在接種后1、2、4和8周的陶瓷共培養(yǎng)系統(tǒng)的HSPCs的髓樣分化潛能。將1000個(gè)細(xì)胞接種在CFU-GEMM培養(yǎng)基(MiltenyiBiotec，德國(guó))中，并可視化集落和在2周后評(píng)分。12。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析利用GraphPad軟件5.0版(GraphPadSoftwareInc.，USA)，對(duì)數(shù)據(jù)組進(jìn)行2因素ANOVA分析，然后Bonferroni校準(zhǔn)。大于或等于0.05的P值被認(rèn)為顯著。數(shù)據(jù)表示為平均值+/-標(biāo)準(zhǔn)偏差。結(jié)果1.在陶瓷中培養(yǎng)7天內(nèi)，MSCs產(chǎn)生具有與骨髓接近的結(jié)構(gòu)相似性的微環(huán)境。3D培養(yǎng)條件對(duì)骨髓MSCs的分化和ECM產(chǎn)生的影響已被廣泛記載。剛性支架，如本研究使用的陶瓷，已顯示出使MSCs易于成骨分化。因此確定在導(dǎo)入HSPCs前陶瓷支架中的3D培養(yǎng)對(duì)MSCs的影響。免疫組織化學(xué)分析顯示，在接種7天后MSCs產(chǎn)生由膠原蛋白I和纖連蛋白組成的ECM的網(wǎng)狀網(wǎng)絡(luò)(圖9A(i，ii))，其中存在MSCs。還產(chǎn)生整聯(lián)蛋白4a(圖9A(iii))。膠原蛋白I和纖連蛋白已知涉及HSC生態(tài)位在骨髓中的保持，并且被認(rèn)為介導(dǎo)HSPCs與骨髓的固定。整聯(lián)蛋白4a已知在生態(tài)位中的MSC-HSC相互作用中起作用。掃描電子顯微鏡(圖9B)揭示MSC接種的陶瓷結(jié)構(gòu)(圖9B(i、iii)與人骨髓基質(zhì)結(jié)構(gòu)(圖9B(ii、iv))的驚人相似性。陽(yáng)性茜素紅(AlizarinRed)(圖9C(i、ii))、VonKossa染色(圖9C(iii、iv))顯示，接種在陶瓷中的MSCs在培養(yǎng)7天后進(jìn)行自發(fā)的成骨分化。與MSCs單層培養(yǎng)相比，早期成骨標(biāo)記——骨橋蛋白——的表達(dá)的Q-PCR分析(圖9D)確認(rèn)，MSCs至少部分自發(fā)成骨分化。在骨內(nèi)生態(tài)位具有推定性影響的其他分子，即Jagged1、N-鈣粘蛋白、BMPR1a、ICAM1和CXCR4，與單層相比，也在3D培養(yǎng)中被上調(diào)，表明MSCs在陶瓷支架中培養(yǎng)時(shí)自發(fā)地產(chǎn)生微環(huán)境，這有助于HSC保持。確定7天是將造血干細(xì)胞和祖細(xì)胞導(dǎo)入系統(tǒng)的適當(dāng)時(shí)間點(diǎn)。2.原始CD34+CD38-HSPCs保持在3D共培養(yǎng)系統(tǒng)中長(zhǎng)至8周。驗(yàn)證3D共培養(yǎng)系統(tǒng)作為支持HSPCs的手段的第一考慮因素是接種到陶瓷中的HSPCs是否進(jìn)入其中，并且長(zhǎng)時(shí)間段保持在其中。利用熒光顯微術(shù)，在接種后1、2、4和8周(圖10A)于共培養(yǎng)系統(tǒng)中檢測(cè)到細(xì)胞追蹤劑-綠色標(biāo)記的HSPCs，表明HSPCs滲入MSC接種的陶瓷，并穩(wěn)定保持長(zhǎng)至8周。未測(cè)試進(jìn)一步的時(shí)間點(diǎn)。為確定HSPCs是否保持其原始(CD34+CD38-)表型和探索3D共培養(yǎng)系統(tǒng)相對(duì)于已應(yīng)用的HSPC培養(yǎng)策略的優(yōu)勢(shì)，通過(guò)CD34和CD38表達(dá)細(xì)胞(圖10B、C、D)的流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)比較了保持在陶瓷共培養(yǎng)系統(tǒng)中與保持在傳統(tǒng)懸浮培養(yǎng)和與骨誘導(dǎo)和非誘導(dǎo)MSC單層的共培養(yǎng)上至4周中原始HSPCs的百分比。發(fā)現(xiàn)保持在陶瓷共培養(yǎng)系統(tǒng)中的CD34+、CD38-細(xì)胞百分比在接種后長(zhǎng)至8周在50％左右保持穩(wěn)定。然而，在所有其他培養(yǎng)條件下，CD34+、CD38-細(xì)胞的比例穩(wěn)定減少(圖10C)，直到存在小于5％的原始HSPCs。發(fā)現(xiàn)單層共培養(yǎng)中大百分比的HSPCs(約50％)為分化(CD34+CD38+)細(xì)胞，其在2周后檢測(cè)不到。在3D系統(tǒng)中也始終觀察到小百分比(<5％)的這些細(xì)胞(圖10D)。3.在陶瓷型共培養(yǎng)系統(tǒng)中保持的HSPCs緩慢分裂并且為靜態(tài)。接著，通過(guò)在第1、2和4周流式細(xì)胞術(shù)分析CFSE標(biāo)記的HPSCs，將3D共培養(yǎng)系統(tǒng)中HSPCs的增殖與之前述及的常規(guī)培養(yǎng)方法進(jìn)行比較。已經(jīng)歷1次或更少分裂(CFSE柱狀圖中從右開(kāi)始前2個(gè)峰)的細(xì)胞被認(rèn)為是慢增殖，而所有其他細(xì)胞被認(rèn)為是快增殖。流式細(xì)胞術(shù)分析和隨后柱狀圖生成(圖11A)顯示，3D共培養(yǎng)系統(tǒng)中的細(xì)胞是所有培養(yǎng)系統(tǒng)中的最慢增殖。發(fā)現(xiàn)3D共培養(yǎng)中大比例(>70％)的HSPCs是慢增殖細(xì)胞。發(fā)現(xiàn)該百分比在第2和4周之間略微(<10％)減少(圖11B)。發(fā)現(xiàn)所有常規(guī)培養(yǎng)中慢增殖細(xì)胞的比例與3D共培養(yǎng)系統(tǒng)相比相對(duì)較低，并且到培養(yǎng)4周時(shí)減少至小于10％(圖11B)。在通過(guò)CD34和CD38的流式細(xì)胞術(shù)分析研究培養(yǎng)1、2和4周后慢和快增殖HSPCs的表型時(shí)，發(fā)現(xiàn)來(lái)自3D共培養(yǎng)系統(tǒng)的HSPCs在培養(yǎng)1、2和4周后保持最大比例的具有原始CD34+CD38-表型的細(xì)胞(圖11C、D、E)。3D共培養(yǎng)的超過(guò)50％的慢和快增殖HSPCs保持原始表型長(zhǎng)至4周。如預(yù)期的，快增殖細(xì)胞中CD34+CD38-細(xì)胞的比例小于慢增殖細(xì)胞中CD34+CD38-細(xì)胞的比例。傳統(tǒng)共培養(yǎng)的慢和快增殖部分中原始細(xì)胞的百分比隨時(shí)間穩(wěn)定減小(圖11C、D、E)。4.在陶瓷型共培養(yǎng)系統(tǒng)中保持的HSPCs是活的和非凋亡的。在已經(jīng)確認(rèn)在3D培養(yǎng)中最佳保持原始HSPC表型的情況下，通過(guò)測(cè)量膜聯(lián)蛋白V——廣泛使用的早期凋亡指示劑——和碘化丙啶(PI)——被晚期凋亡和壞死細(xì)胞獲取——的表達(dá)，確定所有培養(yǎng)系統(tǒng)中的細(xì)胞生活力。在上至第2周，3D共培養(yǎng)系統(tǒng)中很小比例(<0.2％)的HSPCs表達(dá)膜聯(lián)蛋白V(圖12C)，和獲取PI(圖12B)，然后這些細(xì)胞不再存在。在常規(guī)系統(tǒng)中，特別是在懸浮培養(yǎng)和與骨誘導(dǎo)MSCs的共培養(yǎng)中，發(fā)現(xiàn)略大比例的HSPCs(0.5-1.5％)凋亡或壞死(圖12B,C)。由此數(shù)據(jù)，得出如下結(jié)論：在所有培養(yǎng)條件中大部分HSPCs保持存活和非凋亡長(zhǎng)至8周。5.來(lái)自陶瓷共培養(yǎng)的HSPCs具有功能性并且能夠多系分化。在確認(rèn)在3D共培養(yǎng)系統(tǒng)中保持的HSPCs保留其原始表型和存活后，利用CFU-GEMM分析，測(cè)試這些細(xì)胞是否保留HSPCs的多系分化潛能特征。在接種后1、2和4周分離自3D共培養(yǎng)系統(tǒng)的CD34+細(xì)胞生成CFU-GEMM、BFU-E和CFU-GM集落(圖12D)。在計(jì)數(shù)這些集落的基礎(chǔ)上，在不同時(shí)間點(diǎn)未發(fā)現(xiàn)顯著差異(圖12E)。因此，在3D共培養(yǎng)系統(tǒng)中保持的CD34+細(xì)胞不僅存活，而且保留其特征性多系分化潛能。6.3D共培養(yǎng)系統(tǒng)中的HSPCs與其微環(huán)境的ECM和細(xì)胞組分相互作用。最后，為示例在陶瓷共培養(yǎng)系統(tǒng)中較大程度地模擬骨髓HSPC生態(tài)位中的相互作用，研究陶瓷系統(tǒng)中HSPCs和MSCs的物理相互作用。雖然此前觀察到HSPCs和MSCs的共同定位(圖10A)，但未獲得物理接觸的證據(jù)或相互作用機(jī)制的任何標(biāo)志。掃描電子顯微鏡(SEM)揭示，始終發(fā)現(xiàn)在陶瓷共培養(yǎng)系統(tǒng)中具有約10μm直徑的小圓形HSPCs緊密接觸一個(gè)或多個(gè)扁平的大MSCs(圖13B)。為進(jìn)一步闡明這些相互作用所涉及的因素，進(jìn)行免疫組織學(xué)分析。2-光子顯微術(shù)揭示，發(fā)現(xiàn)熒光標(biāo)記的MSCs(紅)和HSPCs(綠)嵌入主要由纖連蛋白和膠原蛋白I組成的ECM網(wǎng)絡(luò)(圖13Aii，iii)。信號(hào)傳導(dǎo)分子C-kit、整聯(lián)蛋白4a和N-鈣粘蛋白的免疫染色顯示，這些分子位于HSPCs與MSCs接觸的區(qū)域(圖13Aiv、v、vi)，表明3D共培養(yǎng)系統(tǒng)中的HSPCs和MSCs通過(guò)這些分子相互作用，十分類似于認(rèn)為在骨髓的骨內(nèi)造血生態(tài)位中存在的相互作用。討論已知骨內(nèi)造血生態(tài)位——其中造血干細(xì)胞和祖細(xì)胞(HSPCs)作為慢增殖原始細(xì)胞保持——是高度復(fù)雜的系統(tǒng)。幾種不同的細(xì)胞類型，包括成骨細(xì)胞、成骨先祖和間充質(zhì)干細(xì)胞，已被發(fā)現(xiàn)有助于生態(tài)位調(diào)控——通過(guò)多種機(jī)制，如生成ECM分子，直接細(xì)胞與細(xì)胞接觸和生成信號(hào)傳導(dǎo)分子。雖然各自的細(xì)胞類型、信號(hào)傳導(dǎo)途徑和物理標(biāo)準(zhǔn)被隱含在生態(tài)位保持的不同方面中，但仍然不清楚這些因素之間的相互作用和其在生態(tài)位中的確切作用。因此，有效模擬骨內(nèi)生態(tài)位的體外模型的開(kāi)發(fā)將會(huì)對(duì)研究生態(tài)位相互作用具有很大用處。最近的研究已經(jīng)顯示，為成功模擬骨內(nèi)生態(tài)位內(nèi)的相互作用，需要存在基質(zhì)支持細(xì)胞和3D結(jié)構(gòu)。若干獨(dú)立研究已經(jīng)揭示，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)在原始、靜態(tài)HSCs的體外保持和增殖中尤其有效。MSCs被認(rèn)為通過(guò)生成信號(hào)傳導(dǎo)分子如整聯(lián)蛋白、包括膠原蛋白I和纖連蛋白的ECM組分以及通過(guò)細(xì)胞相互作用來(lái)介導(dǎo)生態(tài)位保持。已知膠原蛋白I和纖連蛋白通過(guò)結(jié)合表面受體和截獲分泌因子來(lái)介導(dǎo)HSC尋靶(homing)。還已知MSCs是成骨細(xì)胞的前體，成骨細(xì)胞是在生態(tài)位中HSPCs的已知伙伴。已顯示，貢獻(xiàn)于骨髓HSPC生態(tài)位的成骨細(xì)胞是混合群，其包括處于不同分化程度的細(xì)胞。為盡可能接近地模擬所有這些因子，利用羥磷灰石涂布的接種骨髓MSCs的3D陶瓷支架作為臍帶血衍生的HSPCs的培養(yǎng)系統(tǒng)。陶瓷支架被優(yōu)化用于細(xì)胞附著，并已被報(bào)道誘導(dǎo)MSCs的自發(fā)成骨分化。然而，顯示分化程度小于用BMPs或其他因子誘導(dǎo)的培養(yǎng)，表明在單獨(dú)陶瓷支架上培養(yǎng)MSCs，如在骨髓生態(tài)位中那樣，會(huì)生成處于不同成骨分化程度的細(xì)胞群。在對(duì)接種MSCs的陶瓷進(jìn)行免疫組織化學(xué)分析時(shí)，觀察到ECM分子——膠原蛋白I和纖連蛋白——的表達(dá)，其構(gòu)成貫穿陶瓷觀察到的密集網(wǎng)絡(luò)狀結(jié)構(gòu)的主要組分。還檢測(cè)到整聯(lián)蛋白4a的水平增加。MSC接種的陶瓷和股骨頭骨松質(zhì)的掃描電子顯微鏡分析揭示，二者之間高度的結(jié)構(gòu)相似性。該培養(yǎng)系統(tǒng)的實(shí)時(shí)PCR分析顯示，早期成骨標(biāo)記——骨橋蛋白——以及在骨內(nèi)生態(tài)位中具有已知作用的分子——Jagged-1、C-X-C趨化因子受體4型(CXCL12)、BMP受體1A(BMPR1A)、N-鈣粘蛋白和細(xì)胞間附著分子-1(ICAM-1)——的表達(dá)在3D培養(yǎng)中上調(diào)。已知骨橋蛋白通過(guò)限制HSPC增殖和移動(dòng)來(lái)促進(jìn)生態(tài)位保持和HSPCs靜止。Jagged-1被認(rèn)為通過(guò)Notch-信號(hào)傳導(dǎo)來(lái)介導(dǎo)HSPC自更新。CXCL12、BMPR1A和N-鈣粘蛋白均已被隱含在HSC尋靶中，并且ICAM-1是細(xì)胞間結(jié)合的已知介導(dǎo)物。因此，在將MSCs接種到陶瓷支架中1周內(nèi)，觀察到具有與骨髓生態(tài)位結(jié)構(gòu)和分子相似性的微環(huán)境形成。為完成該假定人造生態(tài)位，然后將CD34+HSPCs導(dǎo)入該系統(tǒng)。利用熒光顯微術(shù)，能夠檢測(cè)到在3D共培養(yǎng)系統(tǒng)中熒光標(biāo)記的HSPCs上至8周——在將其導(dǎo)入陶瓷后，表明HSPCs不僅進(jìn)入陶瓷，而且長(zhǎng)時(shí)間保留于此。通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)分析，證明陶瓷共培養(yǎng)中大比例(超過(guò)50％)的HSPCs從培養(yǎng)1周上至8周穩(wěn)定地保留原始CD34+CD38-表型。相反，發(fā)現(xiàn)常規(guī)單層共培養(yǎng)中或作為限定的細(xì)胞因子補(bǔ)充培養(yǎng)基中的懸浮培養(yǎng)而培養(yǎng)的HSPCs始終失去其原始表型。還確認(rèn)所有培養(yǎng)系統(tǒng)中的細(xì)胞均未凋亡或壞死。由于骨內(nèi)生態(tài)位中的原始HSPCs特征還在于其慢速增殖，因此利用CFSE稀釋研究來(lái)研究各培養(yǎng)系統(tǒng)中的HSPC增殖。證明3D共培養(yǎng)系統(tǒng)中的HSPCs，與常規(guī)培養(yǎng)的HSPCs相比，在4周內(nèi)經(jīng)歷極少分裂(<2)。懸浮培養(yǎng)中的細(xì)胞尤其高度增殖。還發(fā)現(xiàn)3D共培養(yǎng)的較大百分比的慢增殖細(xì)胞保留CD34+CD38-表型。在已經(jīng)由此確認(rèn)3D共培養(yǎng)系統(tǒng)能夠在體外長(zhǎng)時(shí)間保持存活的慢增殖的CD34+CD38-HSPCs后；利用CFUGEMM分析證明這些細(xì)胞具有功能性，并且能夠形成紅系和髓樣集落。來(lái)自陶瓷的HSPCs的集落形成能力不隨培養(yǎng)時(shí)間變化，表明功能性HSPCs被穩(wěn)定保持。在檢測(cè)共培養(yǎng)系統(tǒng)中的分子相互作用時(shí)，發(fā)現(xiàn)MSCs和HSPCs在前述纖連蛋白和膠原蛋白I構(gòu)成的網(wǎng)絡(luò)中位置緊密接近。還看到生態(tài)位介導(dǎo)分子：干細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體(C-kit)、N-鈣粘蛋白和整聯(lián)蛋白4a與HSPCs和MSCs共同定位，表明這兩種細(xì)胞類型可通過(guò)這些分子相互作用。C-kit是干細(xì)胞生長(zhǎng)因子的受體，并且被認(rèn)為通過(guò)介導(dǎo)對(duì)生態(tài)位基質(zhì)的附著來(lái)促進(jìn)HSC在生態(tài)位中的保持。N-鈣粘蛋白和整聯(lián)蛋白4a也被認(rèn)為具有相似作用。進(jìn)一步SEM成像揭示了附著MSCs和HSPCs之間的物理相互作用，清楚表明3D共培養(yǎng)系統(tǒng)中的生態(tài)位樣細(xì)胞相互作用。近來(lái)的研究成功在與MSCs的共培養(yǎng)中、在分別由膠原蛋白I和纖維蛋白構(gòu)成的3D凝膠基質(zhì)中保持HSPCs。這些研究有效證明，成功體外保持HSPCs需要3D支架、適當(dāng)ECM和伙伴細(xì)胞的組合。其他工作已證明，成骨分化的細(xì)胞是在3D中HSPCs的有效支持細(xì)胞。單層共培養(yǎng)和移植研究已顯示，MSCs使HSPC保持在體外和體內(nèi)均高度改善。3D共培養(yǎng)系統(tǒng)組合明確限定的剛性支架、自發(fā)地生成適當(dāng)ECM組分和進(jìn)行自發(fā)分化的骨髓MSCs以及原始HSPCs，以產(chǎn)生人造系統(tǒng)，其在細(xì)胞、分子和結(jié)構(gòu)組成方面接近地模擬骨髓HSPC生態(tài)位。這種系統(tǒng)能夠比之前描述的系統(tǒng)使原始HSPCs維持更長(zhǎng)時(shí)間。結(jié)論陶瓷型3D共培養(yǎng)系統(tǒng)接近地模擬骨內(nèi)HSPC生態(tài)位的最重要方面，并且將提供有用的體外模型，以研究健康和患病狀態(tài)的生態(tài)位的相互作用。其作為物質(zhì)測(cè)試平臺(tái)，用于靶向生態(tài)位任意部分的藥物也具有很大的潛能。這種系統(tǒng)還可形成移植的有效HSPC擴(kuò)張策略的基礎(chǔ)。表1分分類骨骼發(fā)育[上調(diào)基因；24h][FD：倍數(shù)變化；AV：平均值]表2分類骨骼發(fā)育[下調(diào)基因；24h][FD：倍數(shù)變化；AV：平均值]表3分類骨骼發(fā)育[上調(diào)基因；28天][FD：倍數(shù)變化；AV：平均值]表4分類骨骼發(fā)育[下調(diào)基因；28天][FD：倍數(shù)變化；AV：平均值]。