本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及4″-O-glucosyl tenvermectins A/B及其利用微生物轉(zhuǎn)化制備的方法和在制備防治農(nóng)林害蟲和害螨藥物中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
天維菌素(Tenvermectin)是新型十六元大環(huán)內(nèi)酯類抗生素，具有廣譜、高效、低毒、劑量小、使用更安全等特點，其中天維菌素A/B的化學(xué)結(jié)構(gòu)式如下：
經(jīng)活性測定，其與阿維菌素、伊維菌素和米爾貝霉素相比，對蚜蟲、螨、鱗翅目類害蟲和其它危害作物的害蟲以及家畜腸道寄生蟲都具有更好的防治效果，是一種前景非常好的新一代環(huán)保型殺蟲劑。
微生物轉(zhuǎn)化是通過微生物細胞將復(fù)雜的底物進行結(jié)構(gòu)修飾，也就是利用微生物代謝過程中產(chǎn)生的某個或某一系列的酶對底物特定部位(基團)進行 催化反應(yīng)，使底物分子結(jié)構(gòu)變化為相類似的另一種化合物。微生物轉(zhuǎn)化具備反應(yīng)定向，產(chǎn)物較為單一，副反應(yīng)少，生物量積累快、轉(zhuǎn)化時間短、轉(zhuǎn)化酶表達效率高，反應(yīng)條件溫和，安全環(huán)保等優(yōu)點，是天然活性化合物進行結(jié)構(gòu)修飾的的一種便利手段。以微生物轉(zhuǎn)化天維菌素A/B，得到新的、結(jié)構(gòu)類似的活性化合物，對拓展開發(fā)利用新一代天維菌素大環(huán)內(nèi)酯類藥物具有重要意義。
技術(shù)實現(xiàn)要素：
本發(fā)明提供4″-O-glucosyl tenvermectins A/B的制備方法及用途，本發(fā)明通過微生物轉(zhuǎn)化天維菌素得到一種新的天維菌素衍生物，具有良好的殺蟲殺螨效果，具有開發(fā)成新一代環(huán)保殺蟲劑的潛力。
本發(fā)明的技術(shù)方案是提供一種4″-O-glucosyl tenvermectins A/B的制備方法，包括如下步驟：
1)制備紅色糖多孢菌種子液：取保藏號為ATCC 11635的紅色糖多孢菌菌株Saccharopolyspora erythraea，劃線接種于YMS固體培養(yǎng)基上，在20-28℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5-7天，將活化后的菌種轉(zhuǎn)接于液體培養(yǎng)基中，置于20-28℃，250rpm的水平搖床中培養(yǎng)40小時，得到種子液；
2)制備4″-O-glucosyl tenvermectins A/B：將種子液轉(zhuǎn)接于轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基中，培養(yǎng)24小時后加入用有機溶劑溶解的轉(zhuǎn)化底物天維菌素A/B，在20-28℃，250rpm的條件下轉(zhuǎn)化培養(yǎng)150小時后，得到發(fā)酵液；采用萃取劑萃取發(fā)酵液并回收萃取劑后純化分離得到4″-O-glucosyl tenvermectins A/B純品；所述4″-O-glucosyl tenvermectins A/B的化學(xué)結(jié)構(gòu)表征為：
本發(fā)明提供的4″-O-glucosyl tenvermectins A/B的制備方法，該方法通過發(fā)酵培養(yǎng)紅色糖多孢菌Saccharopolyspora erythraea(ATCC 11635)，然后在一定時間加入底物天維菌素A/B(tenvermectins A/B)后繼續(xù)培養(yǎng)150h，最后經(jīng)過提取分離得到十六元大環(huán)內(nèi)酯類化合物4″-O-glucosyl tenvermectins A/B。
紅色糖多孢菌菌株在YMS固體培養(yǎng)基上呈淺黃褐色或灰黃色，孢子球形、卵圓形，表面光滑。紅色糖多孢菌是具有菌絲及孢子分化的革蘭氏陽性菌G(+)，會產(chǎn)生由表面多刺的孢子組成的短孢子鏈。產(chǎn)生孢子的方式是由營養(yǎng)氣生菌絲末端開始卷曲，然后菌絲會產(chǎn)生隔膜，將菌絲分為幾段，接著逐漸加厚隔膜成壁，最后形成圓形孢子釋放。該菌購于“美國標準生物品收藏中心”，保藏號為：ATCC 11635。
作為優(yōu)選的技術(shù)方案，所述步驟1)的液體培養(yǎng)基的制備方法為：取葡萄 糖10g、酵母抽提物2g、牛肉抽提物2g和蛋白胨3g，用蒸餾水定容至1000ml后，用1mol/l的NaOH調(diào)節(jié)pH至7.0，采用250ml三角瓶每瓶分裝40ml，在121℃、0.15MPa條件下滅菌20min。
作為優(yōu)選的技術(shù)方案，所述步驟2)的轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基包括碳氮比不同的M-1培養(yǎng)基、M-2培養(yǎng)基、M-3培養(yǎng)基和M-4培養(yǎng)基，其中，
M-1培養(yǎng)基的組分為：葡萄糖5g、紅糖10g、胰蛋白胨5g、酵母抽提物2.5g、乙二胺四乙酸鈉0.036g、甜菜堿1.2g和丙酸鈉0.11g；
M-2培養(yǎng)基的組分為：工業(yè)葡萄糖44g、牛肉膏5.0g、蛋白胨6.0g、酵母抽提物4g、酪蛋白胨3.0g、熱炸黃豆餅粉11.0g、NaCl 1.5g和K2HPO40.5g；
M-3培養(yǎng)基的組分為：葡萄糖50g、黃豆餅粉5g、酵母抽提物5g、蛋白胨4g、NaCl 5g、K2HPO42g和KH2PO41g；
M-4培養(yǎng)基的組分為：工業(yè)葡萄糖50g、NaCl 5g、(NH4)2SO42g、CaCO36g和大豆粉30g；
以上組分用蒸餾水定容至1000ml后，用1mol/l的NaOH調(diào)節(jié)pH至7.0-7.2，250ml三角瓶每瓶分裝40ml，在121℃、0.15MPa條件下滅菌20min。
本發(fā)明還涉及通過改變轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基組分，提高十六元大環(huán)內(nèi)酯類化合物4″-O-glucosyl tenvermectins A/B的轉(zhuǎn)化率的方法。將種子液轉(zhuǎn)接于上述四種不同轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基(M-1培養(yǎng)基、M-2培養(yǎng)基、M-3培養(yǎng)基和M-4培養(yǎng)基)中，這四種轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基的碳源均以葡萄糖為基礎(chǔ)下，氮源多樣化，且具備必要的 微量元素，在其他轉(zhuǎn)化條件均不變的情況下，比較在四組不同培養(yǎng)基條件下天維菌素A/B通過微生物轉(zhuǎn)化為4″-O-glucosyl tenvermectins A/B的轉(zhuǎn)化率的高低。結(jié)果表明轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基M-1的轉(zhuǎn)化率最低，而轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基M-4(碳源為單一葡萄糖，碳氮比約為1.5：1)的轉(zhuǎn)化率最高(詳細情況見實施例)，因此當轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基碳源選為葡萄糖，碳氮比約為1.5：1時，有利于天維菌素A/B微生物轉(zhuǎn)化為4″-O-glucosyl tenvermectins A/B。
作為優(yōu)選的技術(shù)方案，所述步驟2)的有機溶劑包括甲醇、乙醇、DMSO中的一種或幾種。
作為優(yōu)選的技術(shù)方案，所述步驟2)的萃取劑包括乙酸乙酯、正丁醇、醋酸異丁酯、乙醚、石油醚、二氯甲烷或三氯甲烷中的一種或幾種。
作為優(yōu)選的技術(shù)方案，所述步驟2)的純化包括反相高效液相色譜層析。
作為優(yōu)選的技術(shù)方案，所述步驟2)的純化還包括硅膠柱層析。
一種4″-O-glucosyl tenvermectins A/B的用途，4″-O-glucosyl tenvermectins A/B用于制備防治農(nóng)林害蟲或害螨藥物。
作為優(yōu)選的技術(shù)方案，所述農(nóng)林害蟲包括鱗翅目菜蛾科、鱗翅目夜蛾科、鱗翅目枯葉蛾科、鱗翅目螟蟲科、鞘翅目叩甲科、墊刃目滑刃總科中的一種或多種；所述害螨包括葉螨類害蟲。
作為優(yōu)選的技術(shù)方案，所述4″-O-glucosyl tenvermectins A/B包括單一的4″-O-glucosyl tenvermectin A、單一的4″-O-glucosyl tenvermectin B或兩者的混合物。
本發(fā)明的4″-O-glucosyl tenvermectins A/B的制備方法，可制備出轉(zhuǎn)化率高 的4″-O-glucosyl tenvermectins A/B。該4″-O-glucosyl tenvermectins A/B在防治農(nóng)林害蟲或害螨時具有優(yōu)異的效果。
具體實施方式
下面用具體實例予以說明本發(fā)明，應(yīng)該理解的是，實例是用于說明本發(fā)明而不是對本發(fā)明的限制，本發(fā)明的范圍與核心內(nèi)容依據(jù)權(quán)利要求書加以確定。
實施例1
1)取保藏號為ATCC 11635的紅色糖多孢菌菌種，劃線接種于YMS固體培養(yǎng)基上，在28℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7天，將活化后的菌種轉(zhuǎn)接于液體培養(yǎng)基中，置于28℃，250rpm的水平搖床中培養(yǎng)40小時，得到種子液，以5％接種量將種子液轉(zhuǎn)接于轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基中，培養(yǎng)24小時后每瓶轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基中加入500U甲醇溶解的轉(zhuǎn)化底物天維菌素A/B混合物，在28℃，250rpm的條件下繼續(xù)轉(zhuǎn)化培養(yǎng)150小時，得到發(fā)酵液。
2)按上述方法發(fā)酵培養(yǎng)得到3L發(fā)酵液，將發(fā)酵液用6L工業(yè)乙醇浸泡過夜，過濾得乙醇提取液。所得提取液在50℃減壓濃縮去除乙醇相，然后用等體積乙酸乙酯分別萃取三次得乙酸乙酯萃取液，萃取液在50℃減壓條件下濃縮至干，得到5g油狀物質(zhì)。
將所得的油狀物質(zhì)上硅膠柱(粒徑100-200目)進行柱層析，用氯仿：甲醇＝100:0-60:40(V/V)進行梯度洗脫，通過薄層鑒定(TLC)檢測，得到2個組分。將組分2經(jīng)凝膠(Sephadex LH-20)柱層析得到組分2-1，然后使用半制備柱色譜進行進一步純化得到純的4″-O-glucosyl tenvermectin A和4″-O-glucosyl tenvermectin B。
其中薄層鑒定方法：轉(zhuǎn)化后的樣品和空白對照點于硅膠G薄層板上，在氯仿:甲醇(9:1)的展開劑條件展開，跑完后取出晾干，先紫外燈254nm下觀察，再用濃硫酸顯色，檢視轉(zhuǎn)化結(jié)果。
半制備柱色譜條件：流動相：甲醇-乙腈-水(45:45:10)；色譜柱C18，9.4*250mm；檢測波長：244nm；流速：1.5ml/min；柱溫：24.4℃；進樣量為：60ul。收集保留時間為16min和19.7min的峰得到4″-O-glucosyl tenvermectin A和4″-O-glucosyl tenvermectin B。樣品和標準品的配置：稱取適量樣品和標準品，采用流動相為溶劑，配置成溶液。
3)4″-O-glucosyl tenvermectins A和B的結(jié)構(gòu)鑒定
通過1D和2D NMR、MS等波譜分析確定4″-O-glucosyl tenvermectins A/B的結(jié)構(gòu)如下：
4″-O-glucosyl tenvermectin A的理化性質(zhì)如下：
性狀:白色粉末物質(zhì)
溶解性:易溶解于氯仿、丙酮、甲醇，不溶于水
分子式:C51H78O19
ESI-MS m/z:993.23[M-H]-
UVλmax(EtOH)nm(logε):245(4.67)，239(4.63)
IR vmaxcm-1：3387，2930，2875，1721，1646，1450，1383，1340，1305，1270，1170，1062，989
4″-O-glucosyl tenvermectin B的理化性質(zhì)如下：
性狀:白色粉末物質(zhì)
溶解性:易溶解于氯仿、丙酮、甲醇，不溶于水
分子式:C52H80O19
ESI-MS m/z:1007.22[M-H]-
UVλmax(EtOH)nm(logε):245(4.50)，239(4.46)
IR vmaxcm-1：3369，2928，2873，1716，1637，1452，1382，1340，1304，1268，1168，1118，1064，985
1H NMR(CDCl3，400MHz)和13C NMR(CDCl3，100MHz)見表1。
表1 4″-O-glucosyl tenvermectins A和B在CDCl3中的核磁數(shù)據(jù)
(氫譜，400MHz；碳譜，100MHz)
實施例2
取保藏號為ATCC 11635的紅色糖多孢菌種，劃線接種于YMS固體培養(yǎng)基上，在28℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7天，將活化后的菌種轉(zhuǎn)接于液體培養(yǎng)基中，置于28℃，250rpm的水平搖床中培養(yǎng)40小時，得到種子液，以5％接種量將種子液轉(zhuǎn)接于轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基(M-1)中，培養(yǎng)24小時后每瓶轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基中加入甲醇溶解的轉(zhuǎn)化底物天維菌素A/B混合物，在28℃，250rpm的條件下繼續(xù)轉(zhuǎn)化培養(yǎng)150小時，乙酸乙酯萃取發(fā)酵液，后經(jīng)HPLC檢測得4″-O-glucosyl tenvermectins A和B轉(zhuǎn)化率分別為5.77％和7.69％。
實施例3
取保藏號為ATCC 11635的紅色糖多孢菌種，劃線接種于YMS固體培養(yǎng)基上，在28℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7天，將活化后的菌種轉(zhuǎn)接于液體培養(yǎng)基中，置于28℃，250rpm的水平搖床中培養(yǎng)40小時，得到種子液，以5％接種量將種子液轉(zhuǎn)接于轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基(M-2)中，培養(yǎng)24小時后每瓶轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基中加入乙醇溶解的轉(zhuǎn)化底物天維菌素A/B混合物，在28℃，250rpm的條件下繼續(xù)轉(zhuǎn)化培養(yǎng)150小時，乙醚萃取發(fā)酵液，后經(jīng)HPLC檢測得4″-O-glucosyl tenvermectins A和B轉(zhuǎn)化率分別為4.20％和11.15％。
實施例4
取保藏號為ATCC 11635的紅色糖多孢菌種，劃線接種于YMS固體培養(yǎng)基上，在28℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7天，將活化后的菌種轉(zhuǎn)接于液體培養(yǎng)基中，置于28℃，250rpm的水平搖床中培養(yǎng)40小時，得到種子液，以5％接種量將種子液轉(zhuǎn)接于轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基(M-3)中，培養(yǎng)24小時后每瓶轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基中加入DMSO溶解的轉(zhuǎn)化底物天維菌素A/B混合物，在28℃，250rpm的條件下繼續(xù)轉(zhuǎn)化培養(yǎng)150小時，石油醚萃取發(fā)酵液，后經(jīng)HPLC檢測得4″-O-glucosyl tenvermectins A和B轉(zhuǎn)化率分別為7.78％和14.24％。
實施例5
取保藏號為ATCC 11635的紅色糖多孢菌種，劃線接種于YMS固體培養(yǎng)基上，在28℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7天，將活化后的菌種轉(zhuǎn)接于液體培養(yǎng)基中，置于28℃，250rpm的水平搖床中培養(yǎng)40小時，得到種子液，以5％接種量將種子液轉(zhuǎn)接于轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基(M-4)中，培養(yǎng)24小時后每瓶轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基中加入甲醇溶解的轉(zhuǎn)化底物天維菌素A/B混合物，在28℃，250rpm的條件下繼續(xù)轉(zhuǎn)化培養(yǎng)150小時，二氯甲烷萃取發(fā)酵液，后經(jīng)HPLC檢測得4″-O-glucosyl tenvermectins A和B轉(zhuǎn)化率分別為9.74％和19.8％。
實施例6
4″-O-glucosyl tenvermectins A和B對朱砂葉螨的生物活性
供試藥劑：98％(w/w)4″-O-glucosyl tenvermectins A、B，98％(w/w)tenvermectin A：分別稱取1g 98％4″-O-glucosyl tenvermectins A和B加入燒杯 中，并加入93g甲醇和6g表面活性劑壬基酚聚氧乙烯醚，制成濃度為10000mg/L的制劑，用水稀釋成濃度為0.005、0.01、0.02、0.04、0.08mg/L的藥液供試。
供試生物：朱砂葉螨(Tetranychus cinnabarinus)：在人工氣候室條件下[(26±1)℃，RH(70±5)％，H/D14]，接種于蠶豆苗上培養(yǎng)。
實驗方法：采用葉碟浸蟲浸液法：選擇室內(nèi)飼養(yǎng)、生理狀態(tài)一致的成螨蟲。選取生長一致的蠶豆葉片，用打孔器做成直徑2cm葉碟，葉背朝上置于塑料皿中心的脫脂棉上，每皿3片葉蝶，用小號毛筆挑接成螨接種到葉碟上，每葉碟30頭，并加適量水，放于(26±1)℃，光照強度3000～4500lx、14h/d，RH 50％～75％的培養(yǎng)室內(nèi)。2h后于體視顯微鏡下檢查成螨數(shù)，每皿葉碟上螨的數(shù)量不低于20頭。制備好的質(zhì)量濃度0.005、0.01、0.02、0.04、0.08mg/L的藥劑放于燒杯中，用鑷子夾住葉片從低濃度到高濃度依次浸藥，浸藥時間為5s，對照用蒸餾水處理雌成螨，每個質(zhì)量濃度為一處理，每處理重復(fù)3次。待葉片上的藥劑晾干，將處理過的葉碟置于(26±1)℃和14h光周期的人工氣候室培養(yǎng)24h，并于培養(yǎng)皿中加少量水保濕。浸藥后螨蟲非常活躍，處理后5-8小時就開始減慢活動，12-24小時后蟲體靜止。死亡判定標準：檢查時用毛筆輕觸螨體，完全不動者判定為死亡。以朱砂葉螨為試蟲，對4″-O-glucosyl tenvermectins A和B的室內(nèi)活性進行了測定，并以tenvermectin A為對照藥劑，比較了4″-O-glucosyl tenvermectins A和B與tenvermectin A的活性。
結(jié)論：實驗結(jié)果見表2，tenvermectin A對朱砂葉螨的LC50為0.0084mg/L，轉(zhuǎn)化后產(chǎn)物4″-O-glucosyl tenvermectins A/B對朱砂葉螨的LC50分別為0.0156mg/L，0.0113mg/L，轉(zhuǎn)化后產(chǎn)物4″-O-glucosyl tenvermectins A/B與tenvermectin A對朱砂葉螨的活性無顯著性差異。
表2：4″-O-glucosyl tenvermectins A/B對朱砂葉螨的活性
實施例7
4″-O-glucosyl tenvermectins A和B對松材線蟲的活性測定
試驗藥劑：4″-O-glucosyl tenvermectins A/B來自上述實施例，tenvermectin A來自浙江海正藥業(yè)股份有限公司。
供試生物：以松材線蟲為試蟲
試驗方法：采用浸液法。每種藥劑設(shè)立5個質(zhì)量濃度1、2、5、10、20mg/L，每濃度重復(fù)3次，24h統(tǒng)計實驗結(jié)果。
試驗結(jié)果：各種藥劑對松材線蟲的毒力見表3。tenvermectin A對松材線蟲的LC50為2.4391mg/L，轉(zhuǎn)化后產(chǎn)物4″-O-glucosyl tenvermectins A/B對松材線蟲的LC50分別為6.7984mg/L，5.7980mg/L，轉(zhuǎn)化后產(chǎn)物4″-O-glucosyl tenvermectins A/B對松材線蟲的活性與tenvermectin A相比，無顯著性差異。
表3：4″-O-glucosyl tenvermectins A/B對松材線蟲的活性
實施例8
4″-O-glucosyl tenvermectins A和B對小菜蛾的活性測定
試驗藥劑：4″-O-glucosyl tenvermectins A/B來自上述實施例，tenvermectin A來自浙江海正藥業(yè)股份有限公司。
供試生物：以小菜蛾為試蟲
試驗方法：采用藥膜法。每種藥劑設(shè)立5個質(zhì)量濃度25、50、100、200和250mg/L，每濃度重復(fù)3次，24h統(tǒng)計實驗結(jié)果。
試驗結(jié)果：各種藥劑對小菜蛾的毒力見表4。tenvermectin A對小菜蛾在250mg/L的校正死亡率為79.62％，轉(zhuǎn)化后產(chǎn)物4″-O-glucosyl tenvermectins A/B對小菜蛾在250mg/L的校正死亡率分別為70.21％、74.87％，轉(zhuǎn)化后產(chǎn)物4″-O-glucosyl tenvermectins A/B對小菜蛾活性與tenvermectin A相比，無顯著性差異。
表4：4″-O-glucosyl tenvermectins A/B對小菜蛾的活性
實施例9
4″-O-glucosyl tenvermectins A和B對竹螟的活性測定
試驗藥劑：4″-O-glucosyl tenvermectins A/B來自上述實施例，tenvermectin A來自浙江海正藥業(yè)股份有限公司。
供試生物：以竹螟為試蟲
試驗方法：采用浸漬法。每種藥劑設(shè)立5個質(zhì)量濃度1、2、5、10和20mg/L，每濃度重復(fù)3次，24h統(tǒng)計實驗結(jié)果。
試驗結(jié)果：各種藥劑對竹螟的毒力見表5。tenvermectin A對竹螟在20mg/L的校正死亡率為77.52％，轉(zhuǎn)化后產(chǎn)物4″-O-glucosyl tenvermectins A/B對竹螟在20mg/L的校正死亡率分別為68.56％，70.62％，轉(zhuǎn)化后產(chǎn)物4″-O-glucosyl tenvermectins A/B對竹螟的活性與tenvermectin A相比，無顯著性差異。
表5：4″-O-glucosyl tenvermectins A/B對竹螟的活性
本發(fā)明4″-O-glucosyl tenvermectins A/B的制備方法，可制備出轉(zhuǎn)化率高的4″-O-glucosyl tenvermectins A/B。該4″-O-glucosyl tenvermectins A/B在防治農(nóng)林害蟲或害螨時具有優(yōu)異的效果。
本發(fā)明4″-O-glucosyl tenvermectins A/B的用途已經(jīng)通過具體的實例進行了描述，本領(lǐng)域技術(shù)人員可借鑒本發(fā)明內(nèi)容，適當改變原料、工藝條件等環(huán) 節(jié)來實現(xiàn)相應(yīng)的其它目的，其相關(guān)改變都沒有脫離本發(fā)明的內(nèi)容，所有類似的替換和改動對于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是顯而易見的，都被視為包括在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。
以上所述的實施例只是本發(fā)明較佳的方案，并非對本發(fā)明作任何形式上的限制，在不超出權(quán)利要求所記載的技術(shù)方案的前提下還有其它的變體及改型。