本發(fā)明屬于生物能源領(lǐng)域,尤其涉及一種混合菌發(fā)酵合成氣產(chǎn)乙醇的氮缺陷調(diào)控方法。
背景技術(shù):
合成氣發(fā)酵產(chǎn)乙醇是以生物質(zhì)為原料生產(chǎn)乙醇的一種新技術(shù),即生物質(zhì)完全氣化得到CO、H2、CO2為主要成分的合成氣,再利用微生物將合成氣轉(zhuǎn)化成乙醇。該技術(shù)不需要昂貴的酶和酸、堿等試劑,降低了生產(chǎn)成本,且理論上微生物可以完全利用氣體,是一種環(huán)境友好型技術(shù)。
混合培養(yǎng)生物技術(shù)是近年來一個(gè)非常有前景的技術(shù),其理念是從生物工程學(xué)的角度出發(fā),結(jié)合環(huán)境生物技術(shù)的傳統(tǒng)元素,在處理廢棄物的同時(shí)又像工業(yè)生物技術(shù)那樣使產(chǎn)品最大化?;旌吓囵B(yǎng)生物技術(shù)運(yùn)用生態(tài)學(xué)的觀點(diǎn),通過選擇或者調(diào)控壓力對(duì)微生物進(jìn)行生態(tài)調(diào)控。與基于純培養(yǎng)的工業(yè)生物技術(shù)相比較,混合培養(yǎng)技術(shù)具有以下優(yōu)點(diǎn):(1)不需要滅菌;(2)微生物多樣性帶來的適應(yīng)能力;(3)微生物利用混合基質(zhì)的能力;(4)可持續(xù)過程的可能性。
合成氣發(fā)酵產(chǎn)乙醇技術(shù)的研究在國(guó)內(nèi)剛剛起步,由于CO、CO2和H2在液體中的溶解度很低,導(dǎo)致微生物對(duì)氣體的吸收量少,存在乙醇產(chǎn)率較低等問題。目前國(guó)內(nèi)外研究者采用了不同的調(diào)控手段來提高乙醇的產(chǎn)量,主要集中在對(duì)于發(fā)酵條件的調(diào)控,包括培養(yǎng)基的優(yōu)化、pH的控制、氣體傳質(zhì)效率的調(diào)控和氣體組分及各組分氣體分壓的控制等。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)酵母膏濃度對(duì)提高Clostridium autoethanogenum乙醇產(chǎn)率具有重要作用;有報(bào)道稱低酵母提取物濃度有利于Clostridium ljungdahlii序批發(fā)酵提高乙醇與乙酸的摩爾比,研究表明不同的氮營(yíng)養(yǎng)來源和氮營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的濃度都會(huì)在一定程度上影響產(chǎn)乙酸菌代謝產(chǎn)物乙酸和乙醇的濃度和比例。但這些報(bào)道都是基于酵母提取物對(duì)純菌轉(zhuǎn)化合成氣產(chǎn)乙醇的影響研究,沒有涉及混合菌發(fā)酵合成氣產(chǎn)乙醇的氮缺陷調(diào)控方法。
伊內(nèi)奧斯生物股份有限公司發(fā)明的合成氣發(fā)酵方法的操作方法(專利號(hào)CN104822836A)和合成氣發(fā)酵中減少CO2排放和提高醇生產(chǎn)率的方法(專利號(hào)CN104812904A)沒有涉及基于氮缺陷調(diào)控方法的提高混合菌發(fā)酵合成氣產(chǎn)乙醇的方法。中國(guó)科學(xué)技術(shù)大學(xué)提出的一種復(fù)合菌群及其在合成氣發(fā)酵產(chǎn)醇中的應(yīng)用(CN105087441A)也沒有涉及氮缺陷調(diào)控方法。
有鑒于上述的缺陷,本設(shè)計(jì)人,積極加以研究創(chuàng)新,以期創(chuàng)設(shè)一種混合菌發(fā)酵合成氣產(chǎn)乙醇的氮缺陷調(diào)控方法,使其更具有產(chǎn)業(yè)上的利用價(jià)值。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素:
為解決上述技術(shù)問題,本發(fā)明的目的是提供一種混合菌發(fā)酵合成氣產(chǎn)乙醇的氮缺陷調(diào)控方法,乙醇為產(chǎn)乙酸菌非生長(zhǎng)偶聯(lián)型產(chǎn)物,氮營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)不足很可能導(dǎo)致細(xì)胞新陳代謝異常,從而導(dǎo)致細(xì)胞進(jìn)入非生長(zhǎng)狀態(tài)或者休眠狀態(tài),通過氮營(yíng)養(yǎng)缺陷來營(yíng)造不利于產(chǎn)乙酸菌生長(zhǎng)的條件,從而改變代謝途徑從產(chǎn)酸相變化到產(chǎn)溶劑相,達(dá)到調(diào)控產(chǎn)乙醇的目的。
本發(fā)明提出一種混合菌發(fā)酵合成氣產(chǎn)乙醇的氮缺陷調(diào)控方法,包括以下步驟:
第一階段:培養(yǎng)混合菌在發(fā)酵培養(yǎng)基中生長(zhǎng)至穩(wěn)定狀態(tài),即發(fā)酵產(chǎn)物的產(chǎn)量穩(wěn)定不變;
第二階段:將所述第一階段中生長(zhǎng)至穩(wěn)定狀態(tài)的混合菌進(jìn)行第二階段的培養(yǎng),控制該階段的發(fā)酵培養(yǎng)基的氮濃度低于所述第一階段;
所述混合菌為同型產(chǎn)乙酸菌,其來源包括牛糞、城市剩余污泥及其富集物。
進(jìn)一步的,所述第一階段和第二階段中,發(fā)酵培養(yǎng)基包括氮源和基本成分,所述氮源包括酵母提取物或NH4Cl,所述酵母提取物于第一階段中的濃度為1.0~10.0g/L、第一階段中的濃度>第二階段中的濃度≥0.05g/L;所述NH4Cl于第一階段中的濃度為0.5~1.0g/L、第一階段中的濃度>第二階段中的濃度≥0g/L。
進(jìn)一步的,所述基本成分包括K2HPO4 0.25g/L、KH2PO4 0.25g/L、MgCl2·6H2O 0.3g/L、BES 10.5g/L。
進(jìn)一步的,所述第一階段和第二階段的培養(yǎng)過程中,充入合成氣至標(biāo)準(zhǔn)大氣壓,所述合成氣包括體積比為4:3:3的CO、CO2、H2。
進(jìn)一步的,所述第一階段和第二階段的培養(yǎng)溫度為30-55℃,pH為7.0-8.0。
借由上述方案,本發(fā)明至少具有以下優(yōu)點(diǎn):本發(fā)明通過氮營(yíng)養(yǎng)缺陷調(diào)控可達(dá)到提高混合菌合成氣發(fā)酵的乙醇產(chǎn)量的目的,因?yàn)橐掖紴楫a(chǎn)乙酸菌非生長(zhǎng)偶聯(lián)型產(chǎn)物,而氮營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)不足很可能導(dǎo)致細(xì)胞新陳代謝異常,從而導(dǎo)致細(xì)胞進(jìn)入非生長(zhǎng)狀態(tài)或者休眠狀態(tài),通過氮營(yíng)養(yǎng)缺陷來營(yíng)造不利于產(chǎn)乙酸菌生長(zhǎng)的條件,從而改變代謝途徑從產(chǎn)酸相變化到產(chǎn)溶劑相,達(dá)到調(diào)控產(chǎn)乙醇的目的;此方法可適用于木質(zhì)素和纖維素等來源的合成氣發(fā)酵,生產(chǎn)新能源乙醇使得廢物資源化,并降低CO2等溫室氣體的排放,符合可持續(xù)發(fā)展原則;這對(duì)合成氣發(fā)酵產(chǎn)乙醇的大規(guī)模工業(yè)化應(yīng)用提供了重要的理論價(jià)值和實(shí)際指導(dǎo)意義。
上述說明僅是本發(fā)明技術(shù)方案的概述,為了能夠更清楚了解本發(fā)明的技術(shù)手段,并可依照說明書的內(nèi)容予以實(shí)施,以下以本發(fā)明的較佳實(shí)施例并配合附圖詳細(xì)說明如后。
附圖說明
圖1是實(shí)施例1中酵母提取物缺陷調(diào)控混合菌合成氣發(fā)酵的乙醇產(chǎn)量;
圖2是實(shí)施例2中NH4Cl缺陷調(diào)控混合菌合成氣發(fā)酵的乙醇產(chǎn)量;
圖3是實(shí)施例3中酵母提取物缺陷調(diào)控混合菌合成氣發(fā)酵的乙醇產(chǎn)量;
圖4是實(shí)施例4中NH4Cl缺陷調(diào)控混合菌合成氣發(fā)酵的乙醇產(chǎn)量。
具體實(shí)施方式
下面結(jié)合附圖和實(shí)施例,對(duì)本發(fā)明的具體實(shí)施方式作進(jìn)一步詳細(xì)描述。以下實(shí)施例用于說明本發(fā)明,但不用來限制本發(fā)明的范圍。
實(shí)施例1
將50g同型產(chǎn)乙酸菌富集物加入到500mL含有1.0g/L酵母提取物的液體培養(yǎng)基中,充CO/CO2/H2(4:3:3)至一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)大氣壓,調(diào)節(jié)pH=7.0,37℃下進(jìn)行第一階段培養(yǎng),待培養(yǎng)6天后同型產(chǎn)乙酸菌生長(zhǎng)至穩(wěn)定狀態(tài)進(jìn)入第二階段。取10g第一階段培養(yǎng)后的富集物接種至100mL含有0.05g/L酵母提取物的基礎(chǔ)培養(yǎng)基中,置于37℃、100rpm恒溫?fù)u床上培養(yǎng),培養(yǎng)基中基本元素的組分和濃度與第一階段相同:K2HPO4 0.25g/L、KH2PO4 0.25g/L、MgCl2·6H2O 0.3g/L、BES(溴乙烷磺酸鹽)10.5g/L。充CO/CO2/H2(4:3:3)至一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)大氣壓,維持pH 7.0。利用氣相色譜測(cè)量氣體消耗情況和有機(jī)產(chǎn)物生成情況。結(jié)果表明,第二階段乙醇積累量為12.6mmol/L,比第一階段乙醇濃度高出58.3%(圖1)。以上表明,控制第二階段酵母提取物濃度低于第一階段的兩階段培養(yǎng)法能夠極大地提高乙醇產(chǎn)量。
同型乙酸菌的篩選方法如下:
接種200g牛糞于1000mL厭氧瓶,向其中加500mL成分為(L,pH 7):CH3COONa(3.5g),NH4Cl(0.5g),KH2PO4(0.25g),K2HPO4·3H2O(0.25g),MgCl2·6H2O(0.3g),F(xiàn)eCl3·6H2O(25mg),NiSO4·6H2O(16mg),CaCl2(25mg),ZnCl2(11.5mg),CoCl·6H2O(10.5mg),CuCl2·2H2O(5mg),MnCl2·4H2O(15mg)和BES(10.5g)的經(jīng)厭氧處理的富集培養(yǎng)基。頂空充20min N2(99%)至一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)大氣壓,置于37℃、100rpm搖床上培養(yǎng),每24h置換頂空氣體。當(dāng)fhs基因拷貝數(shù)上升并穩(wěn)定時(shí),富集結(jié)束,以此富集物為接種物,進(jìn)行后續(xù)合成氣生物轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)。
實(shí)施例2
將50g同型產(chǎn)乙酸菌富集物加入到500mL含有0.5g/L NH4Cl的液體培養(yǎng)基中,充CO/CO2/H2(4:3:3)至一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)大氣壓,調(diào)節(jié)pH=7.0,37℃下進(jìn)行第一階段培養(yǎng),待培養(yǎng)6天后同型產(chǎn)乙酸菌生長(zhǎng)至穩(wěn)定狀態(tài)進(jìn)入第二階段。取10g第一階段培養(yǎng)后的富集物接種至100mL不含NH4Cl的基礎(chǔ)培養(yǎng)基(除氮源外其他基本組分及濃度同實(shí)施例1)中,置于37℃、100rpm恒溫?fù)u床上培養(yǎng)。充CO/CO2/H2(4:3:3)至一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)大氣壓,維持pH 7.0。利用氣相色譜測(cè)量氣體消耗情況和有機(jī)產(chǎn)物生成情況。結(jié)果表明,第二階段得到乙醇最大積累量為7.8mmol/L,比第一階段最大乙醇積累量高出40.2%(圖2)。以上表明,調(diào)控?zé)o機(jī)氮營(yíng)養(yǎng)缺陷的兩階段培養(yǎng)法有利于乙醇的積累。
同型乙酸菌的篩選方法與實(shí)施例1相同。
實(shí)施例3
將50g同型產(chǎn)乙酸菌富集物加入到500mL含有10g/L酵母提取物的液體培養(yǎng)基中,充CO/CO2/H2(4:3:3)至一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)大氣壓,調(diào)節(jié)pH=7.0,37℃下進(jìn)行第一階段培養(yǎng),待培養(yǎng)6天后同型產(chǎn)乙酸菌生長(zhǎng)至穩(wěn)定狀態(tài)進(jìn)入第二階段。取10g第一階段培養(yǎng)后的富集物接種至100mL含有0.1g/L酵母提取物的基礎(chǔ)培養(yǎng)基中(基本元素組分和濃度同實(shí)施例1),置于37℃、100rpm恒溫?fù)u床上培養(yǎng)。充CO/CO2/H2(4:3:3)至一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)大氣壓,維持pH 7.0。利用氣相色譜測(cè)量氣體消耗情況和有機(jī)產(chǎn)物生成情況。結(jié)果表明,第二階段乙醇積累量為10.9mmol/L,比第一階段乙醇濃度高出45.9%(圖3)。以上表明,控制第二階段酵母提取物濃度低于第一階段的兩階段培養(yǎng)法能夠極大地提高乙醇產(chǎn)量。
同型乙酸菌的篩選方法與實(shí)施例1相同。
實(shí)施例4
將50g同型產(chǎn)乙酸菌富集物加入到500mL含有1.0g/L NH4Cl的液體培養(yǎng)基中,充CO/CO2/H2(4:3:3)至一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)大氣壓,調(diào)節(jié)pH=7.0,37℃下進(jìn)行第一階段培養(yǎng),待培養(yǎng)6天后同型產(chǎn)乙酸菌生長(zhǎng)至穩(wěn)定狀態(tài)進(jìn)入第二階段。取10g第一階段培養(yǎng)后的富集物接種至100mL NH4Cl濃度為0.25g/L的基礎(chǔ)培養(yǎng)基(除氮源外其他組分及濃度同實(shí)施例1)中,置于37℃、100rpm恒溫?fù)u床上培養(yǎng)。充CO/CO2/H2(4:3:3)至一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)大氣壓,維持pH 7.0。利用氣相色譜測(cè)量氣體消耗情況和有機(jī)產(chǎn)物生成情況。結(jié)果表明,第二階段得到乙醇最大積累量為6.2mmol/L,比第一階段最大乙醇積累量高出25.8%(圖4)。以上表明,調(diào)控?zé)o機(jī)氮營(yíng)養(yǎng)缺陷的兩階段培養(yǎng)法有利于乙醇的積累。
同型乙酸菌的篩選方法與實(shí)施例1相同。
以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式,并不用于限制本發(fā)明,應(yīng)當(dāng)指出,對(duì)于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說,在不脫離本發(fā)明技術(shù)原理的前提下,還可以做出若干改進(jìn)和變型,這些改進(jìn)和變型也應(yīng)視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。