本發(fā)明屬于生物化工領(lǐng)域，特別涉及一種鋅-四氮環(huán)配合物及其制備方法和在抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

腫瘤組織缺氧是惡性腫瘤的重要生物學(xué)特征，缺氧是實體瘤中常見現(xiàn)象。缺氧誘導(dǎo)因子(HIF)在腫瘤中發(fā)揮重要作用，缺氧可激活HIF途徑及其介導(dǎo)的兩個最基本功能：血管生成和葡萄糖代謝，進而導(dǎo)致腫瘤惡化，抵抗化療和放療，且增加腫瘤細胞侵入和轉(zhuǎn)移潛能。針對HIF-1α的靶向抗腫瘤研究也是目前抗腫瘤研究的熱點，主要是通過抑制HIF-1α的表達或活性等達到抗腫瘤目的，如化學(xué)藥物、HIF-1α反義核酸藥物等。目前已有一些抑制HIF的化合物進入臨床試驗及通過了FDA認證用于臨床治療癌癥。

與鉑、金、釕貴金屬不同，鋅是人體必需的微量元素，廣泛存在于生物體內(nèi)。Zn²⁺與DNA合成、基因表達、蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性以及催化功能密切相關(guān)，而眾多金屬抗腫瘤藥物中鋅配合物在抗腫瘤活性方面的研究相對較少。

發(fā)明目的

本發(fā)明的目的之一是提供一種鋅-四氮環(huán)配合物。

目的之二是提供上述配合物的制備方法。

目的之三是提供上述配合物或其藥物組合物在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。

為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案：一種鋅-四氮環(huán)配合物，所述配合物C₄₄H₄₂N₅O₃ZnCl的結(jié)構(gòu)式如式1：

所述鋅-四氮環(huán)配合物的制備采用以下步驟：

(1)由2,6-二羥甲基吡啶制備2,6-二溴甲基吡啶(B)；

(2)由二乙烯三胺制備1,4,7-三對甲苯磺?；?1,4,7-三氮雜庚烷(C)；

(3)由B和C制備3,6,9-三對甲苯磺酰基-3,6,9,15-四氮雜[9.3.1]十五元雙環(huán)-1(15),11,13-三烯(D)；

(4)由D制備3,6,9,15-四氮雜[9.3.1]十五元雙環(huán)-1(15),11,13-三烯(L1)；

(5)由L1和1-氯甲基萘制備3,6,9-三甲基萘-3,6,9,15-四氮雜[9.3.1]十五元雙環(huán)-1(15),11,13-三烯(F)；

(6)由F制備配合物C₄₄H₄₂N₅O₃ZnCl。

所述2,6-二溴甲基吡啶的制備采用以下步驟：將2,6-二羥甲基吡啶溶解在48％的HBr溶液中，60℃磁力攪拌反應(yīng)19小時，結(jié)束后將反應(yīng)冷卻至室溫，再繼續(xù)用冰鹽浴冷卻并用冰的飽和碳酸鈉調(diào)至堿性,將生成的白色固體過濾后，用蒸餾水水洗多次，再用正己烷在室溫條件下重結(jié)晶，得到無色透明針狀晶體產(chǎn)物。

所述1,4,7-三對甲苯磺?；?1,4,7-三氮雜庚烷的制備采用以下步驟：將二乙烯三胺溶于丙酮中，冰水浴同時用兩個恒壓滴液漏斗分別滴加NaOH的水溶液和對甲苯磺酰氯的丙酮溶液，之后在常溫下機械攪拌反應(yīng)3小時，反應(yīng)完畢后加入冰水過濾得到白色固體產(chǎn)物。

所述3,6,9-三對甲苯磺?；?3,6,9,15-四氮雜[9.3.1]十五元雙環(huán)-1(15),11,13-三烯(D)的制備采用以下步驟：將2,6-二溴甲基吡啶、1,4,7-三對甲苯磺?；?1,4,7-三氮雜庚烷和NaOH，用N,N-二甲基甲酰胺溶解，在100℃反應(yīng)12小時，反應(yīng)結(jié)束后立刻倒入400mL冰水中充分攪拌，將析出的白色固體用乙醇重結(jié)晶得到白色固體產(chǎn)物。

所述3,6,9,15-四氮雜[9.3.1]十五元雙環(huán)-1(15),11,13-三烯(L1)的制備采用以下步驟：將3,6,9-三對甲苯磺?；?3,6,9,15-四氮雜[9.3.1]十五元雙環(huán)-1(15),11,13-三烯用濃硫酸和鹽酸溶液溶解，將反應(yīng)物在室溫條件下反應(yīng)72小時，反應(yīng)結(jié)束后冷卻至室溫，旋蒸至原來體積的十分之一，之后將所得溶液中緩慢加入無水乙醚析出的黃白色固體過濾，再用無水乙醚洗多次，并在真空下干燥，得到四鹽酸鹽白色固體，將該固體溶于蒸餾水中，用飽和碳酸鈉調(diào)節(jié)pH至9.5，然后將該水溶液用三氯甲烷連續(xù)萃取4小時。最后將三氯甲烷溶液用無水硫酸鈉干燥過夜，過濾旋干，得到淡黃色油狀物并最終在室溫下固化變成淡黃色蠟狀固體產(chǎn)物。

所述3,6,9-三甲基萘-3,6,9,15-四氮雜[9.3.1]十五元雙環(huán)-1(15),11,13-三烯(F)的制備采用以下步驟：將1-氯甲基萘、L1和三乙胺用乙醇溶解，磁力攪拌下室溫反應(yīng)24小時，冷卻至室溫后將所得溶液過濾旋干，將所的產(chǎn)物用三氯甲烷重新溶解，并用蒸餾水洗滌，把有機相合并用無水硫酸鈉干燥過夜，之后過濾旋干得到暗黃色固體，將所得粗產(chǎn)品硅膠柱層析后得到黃色固體產(chǎn)物。

所述配合物C₄₄H₄₂N₅O₃ZnCl(L-Zn)的制備采用以下步驟：將六水合硝酸鋅和F用甲 醇-水混合溶液溶解，用稀鹽酸溶液調(diào)節(jié)pH至7.4，磁力攪拌，回流反應(yīng)1小時，之后將溶液冷卻至室溫并過濾，將所得濾液旋干得到黃色粉末產(chǎn)物。

一種鋅-四氮環(huán)配合物在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。所述腫瘤為肺癌、乳腺癌、肝癌、腎癌或胃癌。

Zn²⁺-四氮環(huán)配合物，具有良好的DNA水解切割活性，以順鉑作為陽性對照藥物，運用MTT方法研究了Zn²⁺-四氮環(huán)配合物對癌細胞株、正常細胞株和順鉑耐藥性細胞株的細胞增殖影響，結(jié)果表明Zn²⁺-四氮環(huán)配合物對細胞增殖的抑制作用比順鉑更好，且對正常肝細胞的毒性略小于肝癌細胞。利用ICR小鼠皮下種植H22肝癌細胞模型研究Zn²⁺-四氮環(huán)配合物體內(nèi)抗腫瘤增殖活性，發(fā)現(xiàn)Zn²⁺-四氮環(huán)配合物有較好的抑制腫瘤增殖活性。

附圖說明

圖1是2,6-二溴甲基吡啶(B)在乙腈中的電噴霧質(zhì)譜圖。

圖2是1,4,7-三對甲苯磺?；?1,4,7-三氮雜庚烷(C)在乙腈中的電噴霧質(zhì)譜圖。

圖3是3,6,9-三對甲苯磺?；?3,6,9,15-四氮雜[9.3.1]十五元雙環(huán)-1(15),11,13-三烯(D)在乙腈中的電噴霧質(zhì)譜圖。

圖4是3,6,9,15-四氮雜[9.3.1]十五元雙環(huán)-1(15),11,13-三烯(L1)在乙腈中的質(zhì)譜圖。

圖5是3,6,9-三甲基萘-3,6,9,15-四氮雜[9.3.1]十五元雙環(huán)-1(15),11,13-三烯(F)在乙腈中的電噴霧質(zhì)譜圖。

圖6是配合物C₄₄H₄₂N₅O₃ZnCl(L-Zn)在緩沖液(50mM Tris-HCl,pH 7.4；乙腈/水,v/v 1/999)中的電噴霧質(zhì)譜圖。分子量727處的峰歸屬于[F+Zn+Cl]⁺(左)，右邊的是理論計算的[F+Zn+Cl]⁺的同位素峰。

圖7是L-Zn(a)和DDP(b)在不同濃度梯度下對A549細胞存活率的影響圖。

圖8是L-Zn(a)和DDP(b)在不同濃度梯度下對NCI-H446細胞存活率的影響圖。

圖9是L-Zn(a)和DDP(b)在不同濃度梯度下對NCI-H1299細胞存活率的影響圖。

圖10是L-Zn(a)和DDP(b)在不同濃度梯度下對Hela細胞存活率的影響圖。

圖11是L-Zn(a)和DDP(b)在不同濃度梯度下對MCF-7細胞存活率的影響圖。

圖12是L-Zn(a)和DDP(b)在不同濃度梯度下對Ketr-3細胞存活率的影響圖。

圖13是L-Zn(a)和DDP(b)在不同濃度梯度下對BGC-823細胞存活率的影響圖。

圖14是L-Zn(a)和DDP(b)在不同濃度梯度下對SGC-7901細胞存活率的影響圖。

圖15是L-Zn(a)和DDP(b)在不同濃度梯度下對SGC-7901/DDP耐藥株細胞存活率的影響圖。

圖16是L-Zn(a)和DDP(b)在不同濃度梯度下對HepG2細胞存活率的影響圖。

圖17是L-Zn(a)和DDP(b)在不同濃度梯度下對LO2細胞存活率的影響圖。

圖18是溶劑DMSO對不同細胞存活率的影響圖。

具體實施方式

下面結(jié)合附圖和具體實施例對本發(fā)明做進一步的說明。

鋅-四氮環(huán)配合物的制備采用以下制備路線：

具體制備步驟和表征如下：

2,6-二溴甲基吡啶(B)的合成與表征：

將2,6-二羥甲基吡啶(10.0g，71.9mmol)加入250mL三口燒瓶中，用恒壓滴液漏斗緩慢滴加48％的HBr(95mL)溶液溶解，之后保持60℃磁力攪拌反應(yīng)19小時。結(jié)束后將反應(yīng)冷卻至室溫，再繼續(xù)用冰鹽浴冷卻并用冰的飽和碳酸鈉調(diào)至堿性。將生成的白色固體過濾后，用蒸餾水水洗多次，再用正己烷在室溫條件下重結(jié)晶，得到無色透明針狀晶體(12.3g，65％)。質(zhì)譜:ES-MS(CH₃CN),m/z(％)：266.00(100)[M+H]⁺。2,6-二溴甲基吡啶(B)在乙腈中的電噴霧質(zhì)譜圖見附圖1。

1,4,7-三對甲苯磺?；?1,4,7-三氮雜庚烷(C)的合成與表征：

將二乙烯三胺(4.4mL)溶于丙酮(40mL)中，加入500mL三口燒瓶中，冰水浴同時用兩個恒壓滴液漏斗分別滴加溶有5M NaOH的水溶液(132mL)和對甲苯磺酰氯(25.2g，132.0mmol)的丙酮溶液(132mL)。之后在常溫下機械攪拌反應(yīng)3小時。反應(yīng)完畢后加入冰 水(800mL)，過濾得到白色固體，烘干(59.7g，80％)。質(zhì)譜:ES-MS(CH₃CN),m/z(％)：588.08(100)[M+Na]⁺。1,4,7-三對甲苯磺酰基-1,4,7-三氮雜庚烷(C)在乙腈中的電噴霧質(zhì)譜圖見附圖2。

3,6,9-三對甲苯磺?；?3,6,9,15-四氮雜[9.3.1]十五元雙環(huán)-1(15),11,13-三烯(D)的合成與表征：

在500mL單口燒瓶中分別加入2,6-二溴甲基吡啶(2.2g，8.3mmol)，1,4,7-三對甲苯磺?；?1,4,7-三氮雜庚烷(4.7g，8.3mmol)和NaOH(2.23g，55.8mmol))，用400mL N,N-二甲基甲酰胺溶解，在100℃反應(yīng)12小時。反應(yīng)結(jié)束后立刻倒入400mL冰水中充分攪拌，將析出的白色固體用乙醇重結(jié)晶得到白色固體(4.4g，79％)。質(zhì)譜:ES-MS(CH₃CN),m/z(％)：691.17(100)[M+Na]⁺。3,6,9-三對甲苯磺?；?3,6,9,15-四氮雜[9.3.1]十五元雙環(huán)-1(15),11,13-三烯(D)在乙腈中的電噴霧質(zhì)譜圖見附圖3。

3,6,9,15-四氮雜[9.3.1]十五元雙環(huán)-1(15),11,13-三烯(L1)的合成與表征：

將3,6,9-三對甲苯磺?；?3,6,9,15-四氮雜[9.3.1]十五元雙環(huán)-1(15),11,13-三烯(5.5g，8.2mmol)加入250mL三口燒瓶中，用濃硫酸和鹽酸(v/v 64/35)溶液(112mL)溶解，將反應(yīng)物在室溫條件下反應(yīng)72小時。反應(yīng)結(jié)束后冷卻至室溫，旋蒸至原來體積的十分之一。之后將所得溶液磁力劇烈攪拌，緩慢加入無水乙醚(15-20mL)，析出的黃白色固體過濾，再用無水乙醚洗多次，并在真空下干燥，得到四鹽酸鹽白色固體。將該固體溶于蒸餾水中(10mL)，用飽和碳酸鈉調(diào)節(jié)pH至9.5，然后將該水溶液用三氯甲烷連續(xù)萃取4小時。最后將三氯甲烷溶液用無水硫酸鈉干燥過夜，過濾旋干，得到淡黃色油狀物并最終在室溫下固化變成淡黃色蠟狀固體(1.0g，59％)。質(zhì)譜:ES-MS(CH₃CN),m/z(％)：207.17(100)[M+H]⁺。3,6,9,15-四氮雜[9.3.1]十五元雙環(huán)-1(15),11,13-三烯(L1)在乙腈中的質(zhì)譜圖見附圖4。

3,6,9-三甲基萘-3,6,9,15-四氮雜[9.3.1]十五元雙環(huán)-1(15),11,13-三烯(F)的合成與表征：

將1-氯甲基萘(830mg,3mmol)，L1(206mg,1mmol)和三乙胺(303mg,3mmol))加入100mL圓底燒瓶中，用50mL乙醇溶解。磁力攪拌下室溫反應(yīng)24小時。冷卻至室溫后將所得溶液過濾旋干，將所的產(chǎn)物用三氯甲烷(200mL)重新溶解，并用蒸餾水洗滌(100mL×3)。把有機相合并用無水硫酸鈉干燥過夜，之后過濾旋干得到暗黃色固體。將所得粗產(chǎn)品硅膠柱層析(三氯甲烷/甲醇v/v 10/1)得到黃色固體F(380mg，61％)。¹H NMR譜(500MHz，CDCl₃)：δH 7.81(d,J＝10Hz,3H),7.73(t,J＝10Hz,3H),7.55-7.61(m,3H),7.48(t,J＝7.5Hz,3H),7.42(t,J＝7.5Hz,3H),7.38(t,J＝7.5Hz,3H),7.26(t,J＝10Hz,1H),7.16-7.20(m,3H),6.91(d,J＝10Hz,2H),3.81(s,4H),3.68(s,2H),3.09(s,4H),2.64(br s,8H)； 氫譜：ES-MS(CH₃CN),m/z(％)：627.67[M+H]⁺。3,6,9-三甲基萘-3,6,9,15-四氮雜[9.3.1]十五元雙環(huán)-1(15),11,13-三烯(F)在乙腈中的電噴霧質(zhì)譜圖見圖5。

配合物C₄₄H₄₂N₅O₃ZnCl(L-Zn)的合成與表征：

將六水合硝酸鋅(149mg,0.5mmol)和F(313mg,0.5mmol)加入50mL圓底燒瓶中，用甲醇-水混合溶液(20mL,v:v 1:1)溶解，用稀鹽酸溶液調(diào)節(jié)pH至7.4，磁力攪拌，回流反應(yīng)1小時。之后將溶液冷卻至室溫并過濾，將所得濾液旋干得到黃色粉末C₄₄H₄₂N₅O₃ZnCl(L-Zn)(288mg,73％)。¹H NMR譜(500MHz，CDCl₃)：δH 7.97(t,J＝10Hz,2H),7.88(t,J＝10Hz,6H),7.61-7.74(m,8H),7.50(t,J＝7.5Hz,4H),7.43(d,J＝10Hz,2H),7.33(t,J＝7.5Hz,2H),4.92(s,2H),4.49(s,4H),4.38(s,2H),4.07(s,2H),3.20(br s,4H),3.06(br s,2H),2.85(br s,2H)；氫譜：ES-MS(50mM Tris-HCl緩沖液,pH 7.4；乙腈/水,v/v1/999),m/z(％)：727.33[M+Zn+Cl]⁺。將以上濾液緩慢揮發(fā)得到用于X-射線單晶衍射測試的黃色塊狀單晶。元素分析：計算值(％)for C₄₄H₄₂N₅O₃ZnCl:C 66.86,H 5.32,N 8.86；實驗值:C 67.02,H 5.54,N 8.65。配合物C₄₄H₄₂N₅O₃ZnCl(L-Zn)在緩沖液(50mM Tris-HCl,pH7.4；乙腈/水,v/v 1/999)中的電噴霧質(zhì)譜圖，分子量727處的峰歸屬于[F+Zn+Cl]⁺(左)，右邊的是理論計算的[F+Zn+Cl]⁺的同位素峰(圖6)。

鋅-四氮環(huán)配合物的抗腫瘤活性表征：

(1)材料

主要儀器：SANYA CO₂培養(yǎng)箱M18，酶聯(lián)免疫測定儀(Thermo Scientific)，江南牌相差顯微鏡，Millipore Milli-Q Advantage超純水系統(tǒng)，Becton-Dickinson流式細胞儀，蔡司共聚焦顯微鏡，Nano Drop微量核酸定量儀，LabConco真空凍干機，Vortex Genie 2振蕩器，小型垂直電泳系統(tǒng)和轉(zhuǎn)膜系統(tǒng)(Bio-rad)，Bio-Rad Gel XR凝膠成像儀，LAS500超靈敏化學(xué)發(fā)光成像儀。

試劑：Zn²⁺-四氮環(huán)配合物(L-Zn)；順鉑(DDP)，3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴鹽(MTT)購于Sigma公司；胎牛血清FBS購于美國HyClone公司；DMEM培養(yǎng)基，常用的無機藥品和有機溶劑均為分析純或者更高級別。

實驗中用到的細胞：

人源腫瘤細胞株：

A549：人肺癌細胞 NCI-H446：人小細胞肺癌細胞

NCI-H1299：人非小細胞肺癌細胞 Hela：人宮頸癌細胞

MCF-7：人乳腺癌細胞 Ketr-3：人腎癌細胞

BGC-803：人胃癌細胞 HepG2：人肝癌細胞

SGC7901：人胃癌細胞

人源正常細胞株：

LO2：人正常肝細胞系

順鉑耐藥細胞株：

SGC7901/DDP：人胃癌順鉑耐藥株

實驗用ICR小鼠，雄性，18-22g，均由南京中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心提供，合格證。

瘤株：腹水型肝癌H22瘤株購買于凱基生物公司。

(2)實驗方法

細胞培養(yǎng)：

細胞培養(yǎng)于含10％胎牛血清的DMEM完全培養(yǎng)基中，37℃、5％CO₂培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細胞貼壁生長，待細胞融合至90％時進行傳代，棄去培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)基，PBS洗兩遍，加入1ml含0.02％EDTA的0.25％胰酶消化，在顯微鏡下觀察細胞變圓，輕拍細胞培養(yǎng)瓶，使細胞脫落，加入3ml DMEM完全培養(yǎng)基終止消化，1,000rpm離心5min。細胞重懸于DMEM完全培養(yǎng)基中，以1：3比例繼續(xù)傳代培養(yǎng)。

體外細胞毒活性(MTT實驗)：

在10cm培養(yǎng)皿培養(yǎng)細胞至對數(shù)生長期，用含0.02％EDTA的0.25％胰酶消化液消化細胞，離心后棄上清收集細胞，血球計數(shù)板計數(shù)并稀釋成2×10⁴的單細胞懸液，將稀釋好的細胞懸液用排槍接種于96孔培養(yǎng)板中，每孔100μL，于37℃，5％CO₂培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細胞貼壁后每孔加入含有不同濃度L-Zn的培養(yǎng)液100μL，設(shè)置6個復(fù)孔。小分子處理24h、48h之后，每孔加入5mg/mL^-1MTT溶液20μL，培養(yǎng)箱中孵育4h后，小心棄孔中培養(yǎng)液，每孔加入150μL DMSO，在平板振蕩器上振蕩培養(yǎng)板20min，使甲瓚晶體充分溶解，用酶標(biāo)儀測量各孔570nm波長的吸收值。

藥物對細胞增殖抑制效果可用細胞的存活率來進行評估：

用Origin Pro8.0軟件擬合不同濃度藥物對細胞增殖的抑制曲線，得到化合物對細胞增殖的抑制效果。

動物實驗：

小鼠的飼養(yǎng)：給藥前后，試驗小鼠，分籠飼養(yǎng)，喂飼全價顆粒飼料(江蘇省協(xié)同醫(yī)藥生 物公司供給)，自由飲水，室溫20±2℃，濕度50～70％。

H22小鼠模型的建立：體外復(fù)蘇培養(yǎng)H22細胞：將H22細胞培養(yǎng)于含體積分數(shù)為10％胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基中(含青霉素1x10-5U/L和鏈霉素100mg/L)中，置于37℃、含5％CO2的培養(yǎng)箱中。在細胞的指數(shù)生長期收集細胞，1,000rpm離心，PBS洗滌2次，離心去上清，用無菌生理鹽水稀釋，調(diào)整到2～3×106/mL。

隨機選取5只健康的ICR小鼠，每只腹腔注射上述H22細胞懸液0.4mL，每天注意觀察接種小鼠的腹水生長情況，約一周后接種小鼠腹部明顯漲大、凸出，將小鼠頸椎脫臼處死，固定于蠟板上，在超凈臺內(nèi)無菌抽取乳白色腹水液，用生理鹽水稀釋，調(diào)整細胞數(shù)為1～2×106/mL，用0.2％臺酚藍染色，計算活細胞數(shù)為95％～98％。取0.2mL于每只小鼠右上肢腋窩消毒后皮下接種。接種40只ICR小鼠。從抽取腹水開始，到接種完最后1只小鼠的總時間控制在lh內(nèi)。

分組和給藥：觀察皮下接種H22的小鼠，10-15后皮下實體瘤體積大概為80-100mm³，將40只小鼠隨機分為五組，分別為溶劑對照組(含與高劑量組等同濃度的溶劑)，L-Zn低劑量組(10mg/kg)，L-Zn中劑量組(25mg/kg)，L-Zn高劑量組(50mg/kg)和順鉑陽性對照組(1.5mg/kg)，每組6只小鼠，除順鉑組尾靜脈注射，其他組均通過灌胃給藥，給藥體積均為100uL，每三天給藥一次，并量取瘤組織的長和寬，通過Volume＝a*b²/2，a為腫瘤最長處長度，b為腫瘤最窄處長度，計算腫瘤體積。給藥5次，末次給藥24h后，頸椎脫臼處死小鼠，解剖剝離瘤塊。

腫瘤抑制率(抑瘤率)的計算：

稱量瘤塊重量，計算腫瘤抑制率。并將各組結(jié)果進行統(tǒng)計學(xué)處理。

療效評價公式：抑瘤率(％)＝(對照組平均瘤重-治療組平均瘤重)/對照組平均瘤重×100％。半定量RT-PCR檢測：

總RNA提?。喝?shù)生長期的細胞，調(diào)節(jié)濃度至4×10⁵/mL，每孔2.5mL接種于6孔平板中，培養(yǎng)至完全貼壁。吸棄舊培養(yǎng)基并用PBS洗滌細胞2次，每孔加入含不同濃度L-Zn的培養(yǎng)基2.5mL，孵育24h后，棄去細胞培養(yǎng)液，用PBS洗滌2次，盡可能棄殘留的PBS，每孔加入1mL Trizol試劑裂解細胞，通過細胞刮刀刮下細胞，并將其轉(zhuǎn)移到1.5mL進口離心管中，4℃避光靜置保存。提RNA前蓋緊樣品管蓋，渦旋儀劇烈振蕩30sec，按體積比1:5加入5份氯仿，劇烈渦旋30sec，室溫靜置10min后，4℃12,000rpm離心10min。離心管內(nèi)出現(xiàn)分層現(xiàn)象，其中下層紅色的為苯酚-氯仿層、中間層及上層的為無色的水相層，RNA存在于水相層中。將水相轉(zhuǎn)移到一個進口的離心管中，不要吸到中間層，加入等體積的異丙醇來沉淀RNA，渦旋混勻，-20℃靜置1h以上，使RNA沉淀充分析出。然后4℃12,000rpm 離心10min，棄掉上層液，用DEPC水配置的75％的乙醇洗滌RNA沉淀兩次，并4℃12,000rpm離心5min，棄乙醇，盡量干燥去除殘留的乙醇，加入20μL無RNase酶的DEPC水使RNA充分溶解，分裝-80℃保存。通過NanoDrop-1000測定提取的RNA的濃度及純度，并用DEPC水稀釋至0.5μg/μL。

cDNA逆轉(zhuǎn)錄：

參照Takara RNA PCR Kit(M-MLV)試劑盒合成cDNA。20μL的反應(yīng)體系如表1

表1

得到的cDNA-80℃保存，使用前適當(dāng)比例稀釋。

引物設(shè)計：從GenBank(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Entrez)中獲取相應(yīng)基因的編碼序列，用Primer 5.0軟件按引物設(shè)計原則設(shè)計引物，并將設(shè)計好的引物在NIH核酸數(shù)據(jù)庫中進行BLAST，以確保引物配對的唯一性。

引物序列：

HIF-1α-sense 5’-AGTGTACCCTAACTAGCCG-3’,

HIF-1α-antisense 5’-CACAAATCAGCACCAAGC-3’,

VEGF-sense 5’-GAAGGAGGAGGGCAGAAT-3’,

VEGF-antisense 5’-CACAGGATGGCTTGAAGAT-3’,

GLUT-1-sense 5’-GATGCAGGTGTTCAAGAG-3’,

GLUT-1-antisense 5’-GAAGGCTACAAAGACCAA-3’,

β-Actin-sense 5’-GACCTGACTGACTACCTC-3’,

β-Actin antisense 5’-TCTTCATTGTGCTGGGTGC-3’.

PCR:以反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物cDNA作為模板，進行PCR擴增反應(yīng)，反應(yīng)體系如表2

表2

反應(yīng)體系混勻后按以下條件進行PCR，見表3：

表3

瓊脂糖凝膠電泳:稱取0.5g瓊脂糖置于錐形瓶中，加入50mL 1×TAE，微波加熱1min至瓊脂糖完全融化，冷卻后加入10μL 0.5μg/mL的溴化乙錠，搖勻，倒入已固定好梳子的制膠槽中配制成1％的瓊脂糖凝膠。膠完全凝固后，垂直輕拔梳子，將凝膠及內(nèi)槽放入電泳槽中。加1×TAE電泳緩沖液超過膠板1-2mm。在點樣板上將PCR產(chǎn)物和點樣緩沖液混合，加樣，80V電泳，當(dāng)溴酚藍移動到距離膠底端1cm處時，停止電泳。運用伯樂凝膠成像系統(tǒng)在紫外光下拍照保存。

圖像處理和分析：用圖像分析軟件Quantity One處理圖片中的條帶，確定目標(biāo)基因條帶灰度值，然后與β-Actin灰度值相比，作直方圖比較。

Western blot檢測：

細胞內(nèi)總蛋白提?。喝?shù)生長期的細胞，調(diào)節(jié)濃度至4×10⁵/mL，每孔2.5mL接種于6孔板中，培養(yǎng)12h左右直至完全貼壁。吸棄舊培養(yǎng)基并用PBS洗滌細胞表面2次，每孔加入含不同濃度L-Zn的培養(yǎng)基2.5mL，孵育24h后經(jīng)預(yù)冷的PBS漂洗后在冰上放置，加入100μL的RIPA裂解液(20mM Tris-HCl(pH 8.0)、250mM NaCl、0.4mM Na₃VO₄、1％SDS和1％蛋白酶抑制劑混合物(cocktail,sigma))冰上裂解30min。用細胞刮刀刮取細胞后，將細胞碎片和裂解液加入到預(yù)冷的1.5mL離心管中。4℃12,000g離心5min，收集上清液并分裝于-80℃保存。用Bradford法測定蛋白濃度。

配制電泳樣品：電泳樣品由細胞全蛋白液、樣品緩沖液和蛋白裂解液組成。依據(jù)已測定的蛋白濃度，吸取一定量的細胞全蛋加樣體積加入5×點樣緩沖液，用蛋白裂解液補足體積，混勻樣品，煮沸5min，冷卻后離心收集吸附于管壁的殘留液體，準(zhǔn)備上樣。

SDS-PAGE電泳：按照《分子克隆實驗指南(第二版)》提供的方案配制12％的分離膠和濃縮膠。濃縮膠的電壓維持80V，等染料前沿進入分離膠后，將電壓提高到120V繼續(xù)電泳直至溴酚藍到達分離膠底部，關(guān)閉電源，卸下凝膠。根據(jù)彩虹蛋白marker條帶的位置確定目的蛋白條帶的大致位置，切去多余部分的凝膠，用去離子水洗滌凝膠2次，用于轉(zhuǎn)膜。

轉(zhuǎn)膜：依據(jù)目標(biāo)凝膠的面積大小，剪取一張適合大小的0.22μm PVDF膜，置于甲醇中活化1min，把含有目標(biāo)條帶的凝膠和PVDF膜都浸入到轉(zhuǎn)膜緩沖液中。1000mL轉(zhuǎn)膜緩沖液配方：39mmol/L甘氨酸、48mmol/L Tris、0.037％SDS和20％甲醇，提前配制在冰上預(yù)冷。按照負極(黑板)-海綿墊-濾紙-凝膠-PVDF膜-濾紙-海綿墊-正極(白板)順序依次裝好，裝墊時保持各層間濕潤并且驅(qū)除各層間的氣泡，加入1L轉(zhuǎn)膜緩沖液，使之完全浸沒凝膠，填入冰盒，將轉(zhuǎn)膜槽放入冰桶使其保持在4℃左右的環(huán)境中，250mA恒流轉(zhuǎn)膜60min。

封閉：預(yù)先將進口脫脂奶粉溶解在TBST緩沖液中配制成5％(m/v)的封閉液。1000mL TBST配方：2.42g Tris-HCl，8g NaCl，調(diào)pH值為7.6，使用前加入0.1％Tween-20。濕轉(zhuǎn)完成后，取出PVDF膜，用10mL TBST緩沖液洗滌2次，然后加入10mL封閉液，在水平搖床上蕩搖1h。

抗體孵育：封閉結(jié)束后，用10mL TBST緩沖液洗滌PVDF膜3次，每次5min。加入用封閉液配置的一抗稀釋液(1:1000)，4℃搖晃過夜，使其充分與目標(biāo)蛋白結(jié)合。一抗孵育完成后，用10mL TBST緩沖液洗滌PVDF膜5次，每次5min。加入用封閉液配置的二抗稀釋液(1:5000)，搖床上室溫孵育1h后用10mL TBST緩沖液洗滌PVDF膜5次，每次5min。

發(fā)光顯影：取少量(依據(jù)PVDF膜的大小而定)ECL試劑盒中A、B試劑等量混合配制成ECL工作液(曝光前10min配制)，避光保存。提前打開曝光儀，連接軟件使其溫度降低至-30℃。濾紙吸干PVDF膜上多余的液體，將其放入儀器暗盒中，滴加適量的ECL工作液，曝光1-10min(視情況而定)，調(diào)整曝光度，保存照片。

圖像處理和分析：用圖像分析軟件Quantity One處理圖片中的條帶，確定目標(biāo)蛋白條帶灰度值，然后與β-actin灰度值相比，作直方圖比較。

酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)檢測：

將對數(shù)生長期的細胞按每孔4×10⁵的密度接種于六孔板內(nèi)培養(yǎng)12h左右直至完全貼壁。吸棄舊培養(yǎng)基并用PBS洗滌細胞表面2次，每孔加入含不同濃度L-Zn的培養(yǎng)基2.5mL，孵育24h后吸取1ml細胞培養(yǎng)液上清，4℃12,000g離心5min，收集上清液并分裝于-80℃保存待用。從密封袋中取出試驗所需板條，空白孔內(nèi)加標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液，其余相應(yīng)孔中加樣品或不同濃度標(biāo)準(zhǔn)品(100μL/孔)，用封板膠紙封住反應(yīng)孔，37℃孵育90min后洗板五次，2min/次。預(yù)先20min配置好生物素化抗體工作液，空白孔內(nèi)加生物素化抗體稀釋液，其余孔內(nèi)加入生物素化抗體工作液(100μL/孔)。用新封板膠紙封住反應(yīng)孔，37℃孵育后洗板五次，2min/次。提前20min配置酶結(jié)合物工作液避光室溫放置?？瞻卓變?nèi)加酶結(jié)合物稀釋液，其余孔內(nèi)加入酶結(jié)合物工作液(100μL/孔)。用新封板膠紙封住反應(yīng)孔，37℃孵育，避光孵育30min后洗板五次，2min/次。加入顯色底物100ul/孔，避光37℃避光孵育15min。加入終止液100μL/孔，混勻后立即通過酶標(biāo)儀測量OD₄₅₀值。繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，然后計算出樣品中的蛋白含量。

(3)結(jié)論

采用MTT法，用Zn²⁺-四氮環(huán)配合物(L-Zn)和順鉑(DDP)分別對9種癌細胞A549、NCI-H446、NCI-H1299、Hela、MCF-7、Ketr-3、BGC823、SGC7901和HepG2；1種正常細胞LO2及1種順鉑耐藥株癌細胞SGC7901/DDP進行了抗腫瘤活性的初步篩選。將相關(guān)數(shù)據(jù)進行分析并擬合細胞生長曲線(如圖7-圖17)經(jīng)計算得出相應(yīng)的IC₅₀值(見表4)。L-Zn和DDP對不同癌細胞增殖抑制呈現(xiàn)濃度依賴性，隨著配合物濃度增高，抑制效應(yīng)增強。L-Zn對所研究的9種癌細胞具有廣譜的抑制作用，從抑制細胞生長曲線可以看出，24h就可以有很好的抑制作用，其對這9種癌細胞的IC₅₀值均小于10μM，均顯著小于相同時間下DDP處理的IC₅₀值，說明L-Zn抑制細胞增殖效果比順鉑抑制效果更好，可能對細胞增殖抑制機理也不同。對于順鉑耐藥性細胞株SGC7901，L-Zn仍有很好的抑制細胞增殖活性，這或許可以改善化療過程中順鉑耐藥性的問題。L-Zn對正常肝細胞系LO2的抑制活性低于肝癌細胞HepG2細胞，說明該配合物的毒副作用可能比較小。L-Zn的溶解性不好，需要DMSO的助溶，通過溶劑對照實驗(圖18)表明DMSO含量在0.5％對細胞是低毒的，不影響L-Zn對細胞增殖的抑制作用。肝癌是全世界第二高致死的癌癥，雖然外科肝切除仍是嚴重的肝細胞癌患者的最佳選擇，而大多數(shù)患者由于腫瘤大小，血管侵襲或肝代謝失調(diào)而被拒絕手術(shù)，因此，研究化療藥物對治療肝癌非常重要。通過MTT法檢測發(fā)現(xiàn)L-Zn對肝癌細胞HepG2細胞有很好的抑制效果，且對正常的肝細胞LO2毒性較低，如L-Zn對HepG2細胞24h的IC₅₀值為6.827±0.209μM，在此濃度下，LO2細胞存活率74％。

表4L-Zn和DDP對不同細胞的IC₅₀值

在實驗結(jié)束后，處死小鼠，剝離腫瘤后稱其重量，順鉑作為陽性對照藥，對腫瘤生長有顯著的抑制作用，腫瘤顯著小于對照組，通過測量計算順鉑對腫瘤的抑制率為55.9％，說明順鉑具有很好的體內(nèi)抗癌活性同時也說明我們的小鼠腫瘤模型是合適的。L-Zn設(shè)置了低、中和高三個濃度梯度，L-Zn對體內(nèi)腫瘤生長的抑制作用存在劑量依賴性，隨著藥物濃度的增高，腫瘤生長的抑制作用越顯著，從低濃度組21.7％的抑制率，到中濃度組36.1％的抑制率以及高濃度組40.9％的抑制率，說明L-Zn對H22肝癌小鼠模型腫瘤增殖具有很好的抑制作用。

雖然本發(fā)明已以較佳實施例公開如上，但實施例和附圖并不是用來限定本發(fā)明，任何熟悉此技藝者，在不脫離本發(fā)明之精神和范圍內(nèi)，自當(dāng)可作各種變化或潤飾，但同樣在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。因此本發(fā)明的保護范圍應(yīng)當(dāng)以本申請的權(quán)利要求保護范圍所界定的為準(zhǔn)。

序列表

<110>南京大學(xué)

<120>鋅-四氮環(huán)配合物及其制備方法和在抗腫瘤藥物中的應(yīng)用

<160>8

<210>SEQ ID N0.1

<211>19

<212>DNA

<213>HIF-1α-sense

<400>

agtgtaccct aactagccg 19

<210>SEQ ID N0.2

<211>18

<212>DNA

<213>HIF-1α-antisense

<400>

cacaaatcag caccaagc 18

<210>SEQ ID N0.3

<211>18

<212>DNA

<213>VEGF-sense

<400>

gaaggaggag ggcagaat 18

<210>SEQ ID N0.4

<211>19

<212>DNA

<213>VEGF-antisense

<400>

cacaggatgg cttgaagat 19

<210>SEQ ID N0.5

<211>18

<212>DNA

<213>GLUT-1-sense

<400>

gatgcaggtg ttcaagag 18

<210>SEQ ID N0.6

<211>18

<212>DNA

<213>GLUT-1-antisense

<400>

gaaggctaca aagaccaa 18

<210>SEQ ID N0.7

<211>18

<212>DNA

<213>β-Actin-sense

<400>

gacctgactg actaccta 18

<210>SEQ ID N0.8

<211>19

<212>DNA

<213>β-Actin antisense

<400>

tcttcattgt gctgggtgc 19