一種快速色譜制備非達霉素的方法與流程

本發(fā)明屬于微生物制藥領域，具體涉及一種快速色譜制備非達霉素的方法。

背景技術：

艱難梭菌是一種革蘭氏陽性厭氧芽孢桿菌，廣泛分布于自然環(huán)境及動物和人的糞便中。其過度生長并釋放毒素時，可引起艱難梭菌感染(CDI)，導致結腸炎癥、嚴重腹瀉甚至死亡。

非達霉素(fidaxomicin)是Optimer制藥公司研發(fā)的一種新型窄譜的大環(huán)內酯類抗生素，于2011年5月獲得FDA批準在美國上市，成為30年來首個主要用于治療艱難梭菌相關性腹瀉(CDAD)的抗生素。非達霉素通過抑制艱難梭菌的RNA聚合酶，阻斷核糖核酸合成而殺菌。與傳統(tǒng)藥物萬古霉素相比，它可顯著降低艱難梭菌感染的復發(fā)率并提高整體治愈率。非達霉素的結構如下：

現有技術中，從發(fā)酵液中提取純化非達霉素的方法有：

中國專利CN104846043A公開了一種從發(fā)酵液中分離和純化非達霉素的工藝；該工藝采用極性有機溶劑浸提菌絲體；浸提液通過大孔吸附樹脂柱并解吸；解吸液用有機溶劑萃取，再經過正相柱層析，得到非達霉素粗品；該粗品經高壓液相色譜設備，以有機溶劑/酸水洗脫，收集高純度非達霉素流出液；洗脫液再經聚苯乙烯微球樹脂柱層析；洗脫液萃取、濃縮、干燥，得到白色粉末狀非達霉素純品，純度96％～97％，收率約73％。該工藝步驟繁瑣，而且使用了高壓液相設備，僅適合于實驗室操作。

中國專利CN104418925A公開了一種制備高純度非達霉素的方法；該方法將從非達霉素發(fā)酵液中分離出的菌絲體用極性有機溶劑浸提；浸提液加水稀釋后導入大孔吸附樹脂SP825L吸附，然后對樹脂柱進行凈化和解吸，得到非達霉素的粗品解吸液Ⅰ，濃縮、結晶后得非達霉素粗品；非達霉素粗品用乙腈的水溶液溶解后，導入UniPS40樹脂柱，經洗脫得到非達霉素洗脫液Ⅱ，蒸除溶解得到固體，再用極性有機溶劑重結晶，得到非達霉素產品。該方法收率50％～60％，純度98.5％以上，但需一次或多次結晶，操作較為繁瑣。

中國專利CN104098637A公開了一種非達霉素的純化方法；該方法將非達霉素發(fā)酵液進行固液分離得到菌絲體，接著用有機溶劑浸泡菌絲體得到含非達霉素的溶液；將該溶液進行納濾濃縮；濃縮液通過裝有C8填料的DAC200制備柱層析，并用含有有機溶劑的酸水溶液進行洗脫，收集、合并含非達霉素的餾分，加水逼出非達霉素，過濾、干燥得到非達霉素干粉，且收率達到50％以上、純度達到99.5％以上。該法操作簡單、獲得非達霉素純度及收率高，但是由于采用了動態(tài)軸向壓縮柱(DAC)技術，對設備和填料規(guī)格要求較高，成本投入較大。

因此，從發(fā)酵液中提取純化非達霉素的方法仍需進行優(yōu)化改進，以期得到一種具有如下優(yōu)點的方法：純度和收率高，同時操作相對簡單、成本投入較低，且適用于工業(yè)化生產。

技術實現要素：

本發(fā)明所要解決的技術問題在于提供一種快速色譜制備非達霉素的方法，不僅所得非達霉素的純度與收率高，而且操作相對簡單、成本較低，并適用于工業(yè)化生產。

本發(fā)明是通過以下技術方案解決上述技術問題的：一種快速色譜制備非達霉素的方法，包括如下具體操作步驟：

(1)、將非達霉素發(fā)酵液進行固液分離得到菌絲體，然后加入60％～80％乙醇浸泡菌絲體并離心，得到非達霉素浸提液，待用；

(2)、將步驟(1)所得的非達霉素浸提液用水稀釋至乙醇濃度為10％～40％，之后導入聚苯乙烯樹脂柱內進行吸附，然后采用乙醇進行梯度解吸，收集非達霉素含量45％以上的解吸液；

(3)、將步驟(2)所收集的解吸液合并，并加水稀釋至乙醇濃度為45％～55％，接著導入反相硅膠層析柱中，采用甲醇-水-乙酸進行梯度洗脫，收集非達霉素含量85％以上的洗脫液；

(4)、將步驟(3)所收集到的洗脫液合并，并采用水稀釋至甲醇濃度為55％～65％，再次導入反相硅膠層析柱中，采用乙腈-水-乙酸進行梯度洗脫，收集非達霉素含量98.5％以上的洗脫液并進行合并，進行濃縮、干燥后得到高純度的非達霉素成品。

進一步地，所述步驟(1)中，60％～80％乙醇的加入量為每千克濕的菌絲體中加入1～8升；浸提溫度為10～50℃；浸提時間為2～8h。

進一步地，所述步驟(2)中，聚苯乙烯樹脂柱為DIAION HP-20聚苯乙烯樹脂柱、納微NM-200聚苯乙烯樹脂柱、D101聚苯乙烯樹脂柱、HPD-400聚苯乙烯樹脂柱、AmberliteXAD-8聚苯乙烯樹脂柱或HZ816聚苯乙烯樹脂柱中的任一種。

進一步地，所述步驟(3)中，反相硅膠層析柱的填料選用C4、C8或C18烷基硅膠鍵合相中的任一種，且粒徑為50μm。

進一步地，所述步驟(4)中，反相硅膠層析柱的填料選用C4、C8或C18烷基硅膠鍵合相中的任一種，且粒徑為50μm。

本發(fā)明的有益效果在于：

提供一種快速色譜制備非達霉素的方法，不僅能夠快速便捷的獲得非達霉素，而且所獲得的非達霉素的純度與收率均高，此外，整個方法操作相對簡單、成本較低，能夠適用于工業(yè)化生產。

【附圖說明】

下面參照附圖結合實施例對本發(fā)明作進一步的描述。

圖1是本發(fā)明實施例1-3中浸提液的HPLC色譜圖。

圖2是本發(fā)明實施例1中解吸液的HPLC色譜圖。

圖3是本發(fā)明實施例1中所收集非達霉素含量85％以上的洗脫液的HPLC色譜圖。

圖4是本發(fā)明實施例1中所收集非達霉素含量98.5％以上的洗脫液的HPLC色譜圖。

圖5是本發(fā)明實施例2中解吸液的HPLC色譜圖。

圖6是本發(fā)明實施例2中所收集非達霉素含量85％以上的洗脫液的HPLC色譜圖。

圖7是本發(fā)明實施例2中所收集非達霉素含量98.5％以上的洗脫液的HPLC色譜圖。

圖8是本發(fā)明實施例3中解吸液的HPLC色譜圖。

圖9是本發(fā)明實施例3中所收集非達霉素含量85％以上的洗脫液的HPLC色譜圖。

圖10是本發(fā)明實施例3中所收集非達霉素含量98.5％以上的洗脫液的HPLC色譜圖。

【具體實施方式】

本發(fā)明一種快速色譜制備非達霉素的方法，包括如下具體操作步驟：

(1)、將非達霉素發(fā)酵液進行固液分離得到菌絲體，然后加入60％～80％乙醇浸泡菌絲體并離心，得到非達霉素浸提液，待用；

(2)、將步驟(1)所得的非達霉素浸提液用水稀釋至乙醇濃度為10％～40％，之后導入聚苯乙烯樹脂柱內進行吸附，然后采用乙醇進行梯度解吸，收集非達霉素含量45％以上的解吸液；

(3)、將步驟(2)所收集的解吸液合并，并加水稀釋至乙醇濃度為45％～55％，接著導入反相硅膠層析柱中，采用甲醇-水-乙酸進行梯度洗脫，收集非達霉素含量85％以上的洗脫液；

(4)、將步驟(3)所收集到的洗脫液合并，并采用水稀釋至甲醇濃度為55％～65％，再次導入反相硅膠層析柱中，采用乙腈-水-乙酸進行梯度洗脫，收集非達霉素含量98.5％以上的洗脫液并進行合并，進行濃縮、干燥后得到高純度的非達霉素成品。

其中，步驟(1)中，60％～80％乙醇的加入量為每千克濕的菌絲體中加入1～8升；浸提溫度為10～50℃；浸提時間為2～8h。步驟(2)中，聚苯乙烯樹脂柱為DIAION HP-20聚苯乙烯樹脂柱、納微NM-200聚苯乙烯樹脂柱、D101聚苯乙烯樹脂柱、HPD-400聚苯乙烯樹脂柱、AmberliteXAD-8聚苯乙烯樹脂柱或HZ816聚苯乙烯樹脂柱中的任一種；可以優(yōu)選納微NM-200聚苯乙烯樹脂柱或HZ816聚苯乙烯樹脂柱。步驟(3)中，反相硅膠層析柱的填料選用C4、C8或C18烷基硅膠鍵合相中的任一種，且粒徑為50μm；可以優(yōu)選C18烷基硅膠鍵合相(粒徑為50μm)。步驟(4)中，反相硅膠層析柱的填料選用C4、C8或C18烷基硅膠鍵合相中的任一種，且粒徑為50μm；可以優(yōu)選C18烷基硅膠鍵合相(粒徑為50μm)。需要說明的是，本發(fā)明中甲醇濃度、乙醇濃度的百分數在無特殊說明的情況下均為體積百分數。

另外，本發(fā)明中所提及的非達霉素發(fā)酵液的發(fā)酵培養(yǎng)所用游動放線菌為Actinoplanes deccanensis ATCC21983，購自美國模式培養(yǎng)物集存庫(ATCC)；DIAION HP-20聚苯乙烯樹脂購自三菱化學株式會社；納微NM-200聚苯乙烯樹脂、D101聚苯乙烯樹脂、HPD-400聚苯乙烯樹脂購自蘇州納微生物科技有限公司；AmberliteXAD-8聚苯乙烯樹脂購自北京慧德易科技有限公司；HZ816聚苯乙烯樹脂購自上海華震科技有限公司；購買而來的聚苯乙烯樹脂在應用時填入相應的柱體內形成相應的聚苯乙烯樹脂柱；反相硅膠層析柱的填料是購自YMC公司；甲醇、乙醇、乙腈等試劑均為市售；水為蒸餾水；高效液相色譜儀為島津LC-20A。

非達霉素檢測采用高效液相色譜法，色譜條件：色譜柱為月旭Ultimate XB-C18(ID4.6mm×250mm，5μm)，流動相為甲醇：0.1％甲酸水溶液(73:27)，流速1mL/min，檢測波長266nm，進樣量10μL，柱溫40℃；非達霉素的保留時間在不同檢測批次間略有波動，范圍在17～18min。

本發(fā)明中非達霉素發(fā)酵液的具體制備過程如下：

a、斜面菌落的制備與培養(yǎng)：將游動放線菌菌體接至斜面培養(yǎng)基上，并于30℃下培養(yǎng)10天；斜面培養(yǎng)基為采用ISP培養(yǎng)基，其配方為：酵母提取物4g/L，麥芽提取物10g/L，葡萄糖4g/L，瓊脂20g/L，pH7.2；

b、種子培養(yǎng)基的配制與培養(yǎng):采用鉑環(huán)將斜面培養(yǎng)基上培養(yǎng)所得的單菌落移入種子培養(yǎng)基中，并在培養(yǎng)溫度30℃下，240rpm搖床振蕩培養(yǎng)48h，獲得非達霉素發(fā)酵的一級種子液；

種子培養(yǎng)基配方:可溶性淀粉20g/L，葡萄糖5g/L，蛋白胨5g/L，酵母粉5g/L，黃豆粉5g/L，硫酸銨0.5g/L，磷酸氫二鉀0.5g/L，七水合硫酸鎂0.5g/L，碳酸鈣2g/L，pH7.2，搖瓶裝液量為50mL/500mL。

c、發(fā)酵培養(yǎng)基的配制與培養(yǎng):以體積百分比為5％的接種量將步驟(b)所獲得的一級種子液移入發(fā)酵培養(yǎng)基中發(fā)酵培養(yǎng)，發(fā)酵培養(yǎng)溫度28℃，240rpm搖床振蕩培養(yǎng)136h，則獲得本發(fā)明所需的非達霉素發(fā)酵液；

發(fā)酵培養(yǎng)基配方:可溶性淀粉4g/L，葡萄糖10g/L，蛋白胨3g/L，酵母提取物1g/L，黃豆粉20g/L，氯化鈉2.5g/L，硫酸銨0.25g/L，磷酸氫二鉀0.25g/L，七水合硫酸鎂0.25g/L，碳酸鈣5g/L，微鹽1mL，pH7.5。

為了能夠清楚的闡述本發(fā)明方法的具體過程，本申請人例舉了如下幾個具體實施例。

實施例1

取非達霉素發(fā)酵液10L，將發(fā)酵液以4500rpm離心10分鐘，得到2kg菌絲體(濕重)；在菌絲體中加入70％乙醇4L，室溫下，電動攪拌器攪拌(350rpm)浸提4小時后離心，收集含非達霉素的浸提液(4.5L，含非達霉素1179mg)，且浸提液的HPLC色譜圖如圖1所示；將浸提液加水稀釋至乙醇濃度為20％后導入納微NM-200聚苯乙烯樹脂柱吸附內進行吸附，樹脂裝量為300mL，流速為2BV/h，樹脂柱依次用濃度40％、50％、60％的乙醇溶液進行梯度解吸，流速為2BV/h，分段收集非達霉素含量45％以上的解吸液，解吸液的HPLC色譜圖如圖2所示。

將收集到的非達霉素含量45％以上的解吸液合并，加水稀釋至乙醇濃度為50％后導入YMC·GEL ODS-A-HG反相硅膠層析柱(柱直徑3cm，柱長38cm)，然后依次用甲醇：水：乙酸＝50：50：0.1(V/V/V)、甲醇：水：乙酸＝70：30：0.1(V/V/V)進行梯度洗脫，洗脫體積分別為3BV、10BV，流速為10mL/min，分段收集非達霉素含量85％以上的洗脫液，該洗脫液的HPLC色譜圖如圖3所示。

將收集到的非達霉素含量85％以上的洗脫液合并，加水稀釋至甲醇濃度為58％后再次導入YMC·GEL ODS-A-HG反相硅膠層析柱(柱直徑3cm，柱長38cm)，然后依次用乙腈：水：乙酸＝30：70：0.1(V/V/V)、乙腈：水：乙酸＝45：55：0.1(V/V/V)進行梯度洗脫，洗脫體積分別為3BV、10BV，流速為10mL/min，分段收集非達霉素含量98.5％以上的洗脫液，該脫液的HPLC色譜圖如圖4所示；合并收集到的非達霉素含量98.5％以上的洗脫液并將其濃縮、干燥得到非達霉素精粉390mg。經測定本實施非達霉素的總收率為33.1％。

根據面積歸一化法計算了本實施例制備過程各步驟中非達霉素的HPLC純度：浸提液中非達霉素純度為33.7％；解吸液中非達霉素純度為55.5％，YMC·GEL ODS-A-HG反相硅膠層析柱的甲醇/水/乙酸洗脫液中非達霉素純度為92.9％，YMC·GEL ODS-A-HG層析柱的乙腈/水/乙酸洗脫液中非達霉素純度為98.8％。

實施例2

取非達霉素發(fā)酵液20L，將發(fā)酵液以4500rpm離心10分鐘，得到3.9kg菌絲體(濕重)；在菌絲體中加入60％乙醇8L，室溫下，電動攪拌器攪拌(350rpm)浸提4小時后離心，收集含非達霉素的浸提液(9L，含非達霉素2358mg)，且浸提液的HPLC色譜圖如圖1所示；將浸提液加水稀釋至乙醇濃度為40％后導入納微NM-200聚苯乙烯樹脂柱吸附內進行吸附，樹脂裝量為500mL，流速為2BV/h，樹脂柱依次用濃度40％、50％、60％的乙醇溶液進行梯度解吸，流速為2BV/h，分段收集非達霉素含量45％以上的解吸液，解吸液的HPLC色譜圖如圖5所示。

將收集到的非達霉素含量45％以上的解吸液合并，加水稀釋至乙醇濃度為45％后導入YMC·GEL ODS-A-HG反相硅膠層析柱(柱直徑3cm，柱長38cm)，然后依次用甲醇：水：乙酸＝50：50：0.1(V/V/V)、甲醇：水：乙酸＝70：30：0.1(V/V/V)進行梯度洗脫，洗脫體積分別為4BV、10BV，流速為10mL/min，分段收集非達霉素含量85％以上的洗脫液，該洗脫液的HPLC色譜圖如圖6所示。

將收集到的非達霉素含量85％以上的洗脫液合并，加水稀釋至甲醇濃度為55％后再次導入YMC·GEL ODS-A-HG反相硅膠層析柱(柱直徑3cm，柱長38cm)，然后依次用乙腈：水：乙酸＝30：70：0.1(V/V/V)、乙腈：水：乙酸＝50：50：0.1(V/V/V)進行梯度洗脫，洗脫體積分別為3BV、10BV，流速為12mL/min，分段收集非達霉素含量98.5％以上的洗脫液，該脫液的HPLC色譜圖如圖7所示；合并收集到的非達霉素含量98.5％以上的洗脫液并將其濃縮、干燥得到非達霉素精粉806mg；經測定本實施非達霉素的總收率為34.2％。

根據面積歸一化法計算了本實施例制備過程各步驟中非達霉素的HPLC純度：浸提液中非達霉素純度為33.7％；解吸液中非達霉素純度為58.8％，YMC·GEL ODS-A-HG反相硅膠層析柱的甲醇/水/乙酸洗脫液中非達霉素純度為92.7％，YMC·GEL ODS-A-HG層析柱的乙腈/水/乙酸洗脫液中非達霉素純度為99.1％。

實施例3

取非達霉素發(fā)酵液30L，將發(fā)酵液以4500rpm離心10分鐘，得到5.9kg菌絲體(濕重)；在上述菌絲體中加入80％乙醇12L，室溫下，電動攪拌器攪拌(350rpm)浸提4小時后離心，收集含非達霉素的浸提液(13.6L，含非達霉素3531mg)，且浸提液的HPLC色譜圖如圖1所示；將浸提液加水稀釋至乙醇濃度為10％后導入納微NM-200聚苯乙烯樹脂柱吸附，樹脂裝量為500mL，流速為2BV/h，樹脂柱依次用濃度40％、50％、60％的乙醇溶液進行梯度解吸，流速為2BV/h，分段收集收集非達霉素含量45％以上的解吸液，解吸液的HPLC色譜圖如圖8所示。

將收集到的非達霉素含量45％以上的解吸液合并，加水稀釋至乙醇濃度為55％后導入YMC·GEL ODS-A-HG反相硅膠層析柱(柱直徑4.6cm，柱長40cm)，然后依次用甲醇：水：乙酸＝50：50：0.1(V/V/V)、甲醇：水：乙酸＝70：30：0.1(V/V/V)進行梯度洗脫，洗脫體積分別為2BV、10BV，流速為25mL/min，分段收集非達霉素含量85％以上的洗脫液，該洗脫液的HPLC色譜圖如圖9所示。

將收集到的非達霉素含量85％以上的洗脫液合并，加水稀釋至甲醇濃度為65％后再次導入YMC·GEL ODS-A-HG反相硅膠層析柱(柱直徑4.6cm，柱長40cm)，然后依次用乙腈：水：乙酸＝30：70：0.1(V/V/V)、乙腈：水：乙酸＝45：55：0.1(V/V/V)進行梯度洗脫，洗脫體積分別為2BV、10BV，流速為25mL/min，分段收集非達霉素含量98.5％以上的洗脫液，該洗脫液的HPLC色譜圖如圖10所示；合并收集到的非達霉素含量98.5％以上的洗脫液并將其濃縮、干燥得到非達霉素精粉1144mg；經測定本實施非達霉素的總收率為32.4％。

根據面積歸一化法計算了本實施例制備過程各步驟中非達霉素的HPLC純度：浸提液中非達霉素純度為33.7％；解吸液中非達霉素純度為55.1％，YMC·GEL ODS-A-HG反相硅膠層析柱的甲醇/水/乙酸洗脫液中非達霉素純度為88.5％，YMC·GEL ODS-A-HG層析柱的乙腈/水/乙酸洗脫液中非達霉素純度為98.9％。

綜上，本發(fā)明方法，不僅能夠快速便捷的獲得非達霉素，而且所獲得的非達霉素的純度與收率均高，此外，整個方法操作相對簡單、成本較低，能夠適用于工業(yè)化生產。