用于診斷PAH基因突變的雜交膜條、PCR引物及試劑盒的制作方法

本發(fā)明涉及分子生物學(xué)檢測(cè)，特別涉及一種用于診斷苯丙氨酸羥化酶(phenylalaninehydroxylase，PAH)基因突變的雜交膜條及用于擴(kuò)增待檢樣品基因片段的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PolymeraseChainReaction，縮略詞為PCR)引物和用于診斷PAH基因突變的試劑盒。
背景技術(shù)：
：苯丙酮尿癥(phenylketonuria，PKU)是嚴(yán)重威脅人類(lèi)健康的一種常染色體隱性遺傳性苯丙氨酸代謝異常病，絕大部分(98％-99％)是由苯丙氨酸羥化酶(phenylalaninehydroxylase，PAH)基因缺陷所致，使得PAH活性下降或缺乏，導(dǎo)致苯丙氨酸不能正常代謝，血液、組織中的丙氨酸及其旁路代謝產(chǎn)物堆積，最終導(dǎo)致中樞神經(jīng)系統(tǒng)受到不可逆的損害，而出現(xiàn)精神行為異常、癲癇和智力低下等癥狀。許多研究顯示PAH基因突變表現(xiàn)為高度遺傳異質(zhì)性，在不同的民族和人種之間存在較大的差異。我國(guó)的平均發(fā)病率為1/11188。苯丙酮尿癥可以通過(guò)飲食控制治療，一般需終身采用無(wú)(低)苯丙氨酸飲食療法，早發(fā)現(xiàn)早治療是其治療的關(guān)鍵，但是昂貴的治療費(fèi)用給家庭和社會(huì)帶來(lái)了沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，而且不能從根本上降低PKU患兒的出生率。因此在出生前對(duì)胎兒進(jìn)行診斷，預(yù)防患兒出生，能夠減少社會(huì)和家庭的負(fù)擔(dān)，提高人口素質(zhì)，具有較高的臨床應(yīng)用價(jià)值。造成苯丙酮尿癥的原因一般為遺傳因素。苯丙酮尿癥絕大部分由PAH基因突變引起，國(guó)際上報(bào)道的PAH基因突變有500多種，但其中有61.5％是錯(cuò)義突變，13.5％是缺失突變，11.5％是剪切突變，其它還有插入、沉默等多種突變形式。不同種族和地區(qū)人群之間PAH基因突變位點(diǎn)及分布具有較大差異。如歐洲最常見(jiàn)的是R408W，IVS10-11G->A，IVS12+1G->A。俄羅斯遠(yuǎn)東地區(qū)PKU患者，發(fā)現(xiàn)R408W占63％。通過(guò)對(duì)古巴的28例PKU病人的檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)古巴PKU患者的突變熱點(diǎn)為E208K(19.3％)和R261Q(15.8％)。對(duì)意大利PKU患者的分析，發(fā)現(xiàn)IVS10n-t11G>A(19.4％)和R261Q(13.5％)是意大利PKU患者的突變熱點(diǎn)。國(guó)際PAH基因研究協(xié)作組報(bào)道東方黃種人(日本、韓國(guó)、中國(guó))的高頻突變位點(diǎn)是位于第12外顯子的R413P(25％)和位于第7外顯子的R243Q(18％)。這為我們大規(guī)模有針對(duì)性的開(kāi)展PAH基因突變篩查及診斷提供了理論依據(jù)。目前，傳統(tǒng)基因診斷方法包括酶切，限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性分析(restrictionfragmentlengthpolymorphism，RFLP)，直接測(cè)序等，這些方法或者不能定性，或者耗時(shí)費(fèi)力、所需設(shè)備和耗材昂貴，更重要的是這些方法難以同時(shí)對(duì)多個(gè)基因突變位點(diǎn)進(jìn)行檢測(cè)。而基因芯片法雖然能同時(shí)對(duì)不同基因位點(diǎn)進(jìn)行檢測(cè)，但它所需設(shè)備和耗材昂貴，不適用于在臨床大規(guī)模推廣，應(yīng)用受到限制。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是：彌補(bǔ)上述現(xiàn)有技術(shù)的不足，提出一種用于診斷PAH基因突變的雜交膜條、一種用于擴(kuò)增待檢樣品基因片段的PCR引物，以及一種用于診斷PAH基因突變的試劑盒。本發(fā)明采用以下技術(shù)方案：一種用于診斷PAH基因突變的雜交膜條，包括基底，以及固定在所述基底上的突變檢測(cè)探針，每一條所述突變檢測(cè)探針?lè)謩e對(duì)應(yīng)包含一個(gè)PAH基因突變位點(diǎn)，所述PAH基因突變位點(diǎn)包括以下位點(diǎn)：R111X、R176X、EX6-96A>G、R241C、R243Q、R252Q、Y356X、V399V和R413P；每一條所述突變檢測(cè)探針包含15-25個(gè)堿基的序列，在所述序列的中部位置包含其相對(duì)應(yīng)的PAH基因突變位點(diǎn)的突變堿基；所述突變檢測(cè)探針為SEQIDNO.1～SEQIDNO.9所示的序列或其反向互補(bǔ)序列的DNA。優(yōu)選的，還包括分別與每一條所述突變檢測(cè)探針對(duì)應(yīng)的正常對(duì)照探針，所述正常對(duì)照探針固定在所述基底上的與所述突變檢測(cè)探針不同的位置上。優(yōu)選的，所述正常對(duì)照探針為SEQIDNO.10～SEQIDNO.18所示的序列或其反向互補(bǔ)序列的DNA。優(yōu)選的，所述突變檢測(cè)探針的3’或5’端帶有氨基標(biāo)記。優(yōu)選的，所述正常對(duì)照探針的3’或5’端帶有氨基標(biāo)記。一種用于擴(kuò)增待檢樣品基因片段的PCR引物，所述PCR引物的擴(kuò)增產(chǎn)物含所述的PAH基因突變位點(diǎn)，所述PCR引物為以下5對(duì)：SEQIDNO.19和SEQIDNO.20；SEQIDNO.21和SEQIDNO.22；SEQIDNO.23和SEQIDNO.24；SEQIDNO.25和SEQIDNO.26；SEQIDNO.27和SEQIDNO.28；其中SEQIDNO.19、SEQIDNO.21、SEQIDNO.23、SEQIDNO.25、SEQIDNO.27是上游引物；SEQIDNO.20、SEQIDNO.22、SEQIDNO.24、SEQIDNO.26、SEQIDNO.28是下游引物。優(yōu)選地，所述擴(kuò)增產(chǎn)物分別包括如下位點(diǎn)：引物SEQIDNO.19和SEQIDNO.20的擴(kuò)增產(chǎn)物包含R111X位點(diǎn)，引物SEQIDNO.21和SEQIDNO.22的擴(kuò)增產(chǎn)物包含R176X、EX6-96A>G位點(diǎn)，引物SEQIDNO.23和SEQIDNO.24的擴(kuò)增產(chǎn)物包含R241C、R243Q、R252Q位點(diǎn)，引物SEQIDNO.25和SEQIDNO.26的擴(kuò)增產(chǎn)物包含Y356X、V399V位點(diǎn)，引物SEQIDNO.27和SEQIDNO.28的擴(kuò)增產(chǎn)物包含R413P位點(diǎn)。優(yōu)選地，所述上游引物和/或下游引物的5’端帶有生物素或熒光標(biāo)記。一種用于診斷PAH基因突變的試劑盒，其包含所述的用于診斷PAH基因突變的雜交膜條，以及含有所述的用于擴(kuò)增待檢樣品基因片段的PCR引物的PCR反應(yīng)液。本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)對(duì)比的有益效果是：本發(fā)明是基于PCR-膜條雜交技術(shù)的基因檢測(cè)方法，能同時(shí)對(duì)多個(gè)不同基因突變位點(diǎn)進(jìn)行檢測(cè)，由于固定在基底上的突變檢測(cè)探針的大致中間位置包含有PAH基因的基因突變位點(diǎn)，通過(guò)PCR-膜條雜交技術(shù)能直接對(duì)待檢者的基因型進(jìn)行確診，對(duì)正常、突變雜合子、突變純合子等很容易判斷，具有高通量、高效率、價(jià)格低廉、使用方便等優(yōu)點(diǎn)，有利于實(shí)現(xiàn)臨床快速檢測(cè)和大規(guī)模人群篩查。附圖說(shuō)明圖1是本發(fā)明實(shí)施例的未檢出PAH基因突變樣品結(jié)果示例；圖2是本發(fā)明實(shí)施例的PAH基因突變雜合子樣品結(jié)果示例；圖3是本發(fā)明實(shí)施例的PAH基因突變純合子樣品結(jié)果示例；圖4是本發(fā)明實(shí)施例的PAH基因突變雙重雜合子樣品結(jié)果示例。具體實(shí)施方式下面對(duì)照附圖和結(jié)合優(yōu)選具體實(shí)施方式對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)的闡述。1、雜交膜條的制備1.1、9條突變檢測(cè)探針和9條正常對(duì)照探針的制備按照表1和表2中的序列合成18條探針，突變檢測(cè)探針和/或正常對(duì)照探針的3’或5’端帶氨基標(biāo)記，合成的方法為現(xiàn)有的常規(guī)的DNA合成法。表1：表2：注：表1和表2中的“M”代表突變檢測(cè)探針，“N”代表正常對(duì)照探針。突變檢測(cè)探針SEQIDNO.1～SEQIDNO.9分別對(duì)應(yīng)包含一個(gè)如下所示的PAH基因突變位點(diǎn)：R111X、R176X、EX6-96A>G、R241C、R243Q、R252Q、Y356X、V399V、R413P，每一條突變檢測(cè)探針包含15-25個(gè)堿基的序列，在序列的中部位置包含其相對(duì)應(yīng)的苯丙氨酸羥化酶基因的突變堿基。每一個(gè)正常對(duì)照探針都對(duì)應(yīng)一條突變檢測(cè)探針，其和突變檢測(cè)探針固定在基底的不同位置上，SEQIDNO.10對(duì)應(yīng)的基因突變位點(diǎn)為R111X，SEQIDNO.11對(duì)應(yīng)的基因突變位點(diǎn)為R176X，SEQIDNO.12對(duì)應(yīng)的基因突變位點(diǎn)為EX6-96A>G，SEQIDNO.13對(duì)應(yīng)的基因突變位點(diǎn)為R241C，SEQIDNO.14對(duì)應(yīng)的基因突變位點(diǎn)為R243Q，SEQIDNO.15對(duì)應(yīng)的基因突變位點(diǎn)為R252Q，SEQIDNO.16對(duì)應(yīng)的基因突變位點(diǎn)為Y356X，SEQIDNO.17對(duì)應(yīng)的基因突變位點(diǎn)為V399V，SEQIDNO.18對(duì)應(yīng)的基因突變位點(diǎn)為R413P。1.2、雜交膜條的制備a.用打印機(jī)在基底(本實(shí)施例中為尼龍膜)上打印位點(diǎn)陣列，并標(biāo)明相應(yīng)位點(diǎn)的探針名稱(chēng)，正常對(duì)照探針與突變檢測(cè)探針固定在基底的不同位置上；b.用5％的EDAC溶液泡膜30分鐘，以活化尼龍膜表面的羧基；c.分別用探針稀釋液(10mmol/LTris，pH8.0)將18條探針稀釋至5μmol/L；d.按尼龍膜條上打印的位點(diǎn)陣列，將18條探針按探針名稱(chēng)對(duì)應(yīng)分別點(diǎn)加在尼龍膜相應(yīng)位點(diǎn)上，探針上的氨基與尼龍膜表面的羧基發(fā)生交聯(lián)反應(yīng)；e.待尼龍膜條干燥后，用0.1mol/L的NaOH泡膜5分鐘，以封閉尼龍膜表面未反應(yīng)的羧基；f.用純水洗滌尼龍膜，干燥后備用。表3：本例中尼龍膜條上的探針陣列如下：111N111M241N241M356N356M176N176M243N243M399N399MEX6-96NEX6-96M252N252M413N413M注：“M”代表突變檢測(cè)探針，“N”代表正常對(duì)照探針。2、PCR引物擴(kuò)增根據(jù)本項(xiàng)目待檢的9個(gè)突變位點(diǎn)的位置關(guān)系，設(shè)計(jì)了5對(duì)引物分別進(jìn)行擴(kuò)增，如表4所示，其中SEQIDNO.19、SEQIDNO.21、SEQIDNO.23、SEQIDNO.25、SEQIDNO.27是上游引物，分別簡(jiǎn)寫(xiě)為PKU1F、PKU2F、PKU3F、PKU4F、PKU5F；SEQIDNO.20、SEQIDNO.22、SEQIDNO.24、SEQIDNO.26、SEQIDNO.28是下游引物，分別簡(jiǎn)寫(xiě)為PKU1R、PKU2R、PKU3R、PKU4R、PKU5R；該表中，引物PKU1F和PKU1R擴(kuò)增PAH基因的R111X位點(diǎn)，引物PKU2F和PKU2R擴(kuò)增PAH基因的R176X、EX6-96A>G位點(diǎn)，引物PKU3F和PKU3R擴(kuò)增PAH基因的R241C、R243Q、R252Q位點(diǎn)，引物PKU4F和PKU4R擴(kuò)增PAH基因的Y356X、V399V位點(diǎn)，引物PKU5F和PKU5R擴(kuò)增PAH基因的R413P位點(diǎn)，如表4所示：表4：上游引物下游引物擴(kuò)增基因包含的檢測(cè)位點(diǎn)的突變類(lèi)型PKU1FPKU1RPAHR111XPKU2FPKU2RPAHR176X、EX6-96A>GPKU3FPKU3RPAHR241C、R243Q、R252QPKU4FPKU4RPAHY356X、V399VPKU5FPKU5RPAHR413P上游引物和/或下游引物的5’端帶有生物素或熒光素(如Cy3、Cy5等)標(biāo)記。本發(fā)明實(shí)施例為對(duì)下游引物(PKU1R、PKU2R、PKU3R、PKU4R、PKU5R)進(jìn)行生物素標(biāo)記，其PCR擴(kuò)增后的產(chǎn)物可與本發(fā)明實(shí)施例中的探針雜交，PCR引物的DNA序列如表5所示。表5：2.1、提取模板DNA：使用其它商業(yè)化試劑盒從待檢者的血液中提取模板DNA。2.2、合成10條引物：合成的方法為現(xiàn)有的常規(guī)的DNA合成法。2.3、配制PCR反應(yīng)液：配制成25μL/人份的PCR反應(yīng)液，每人份的PCR反應(yīng)液中各成份及濃度分別為：10條引物濃度分別為0.2μmol/L、Taq酶為0.1U/μL、1×PCRBuffer、MgCl2為1.5mmol/L、dNTP為0.2mmol/L、模板DNA1～10ng/μL。2.4、PCR擴(kuò)增：PCR擴(kuò)增的反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃預(yù)變性5分鐘；95℃變性30秒，55℃復(fù)性30秒，72℃延伸45秒，循環(huán)35次；72℃再延伸5分鐘。PCR擴(kuò)增后的產(chǎn)物包含待測(cè)病人的DNA片段。3、雜交及顯色3.1.雜交將PCR擴(kuò)增后的產(chǎn)物與步驟1.2中的尼龍膜條加入到12mL的雜交液(2×SSC、0.1％SDS，pH7.4)中，在雜交箱中44℃雜交2～4小時(shí)以上。3.2.洗膜將尼龍膜條轉(zhuǎn)移到預(yù)熱至44℃的洗液(0.5×SSC、0.1％SDS，pH7.4)中，于44℃洗滌15分鐘。3.3.過(guò)氧化物酶(Peroxidase，縮略詞為POD)孵育將膜條放入新鮮配制的0.25U/mL的鏈霉親合素-POD(streptin-POD)溶液中，37℃孵育15分鐘，使鏈霉親合素與PCR產(chǎn)物中的生物素結(jié)合，POD連接到PCR產(chǎn)物上，洗去多余的streptin-POD。3.4.顯色現(xiàn)配顯色液(0.1mol/L檸檬酸鈉、0.1mg/mLTMB、0.0015％H2O2)，將膜條放入顯色液中避光顯色10分鐘，有雜交產(chǎn)物的膜條上相應(yīng)探針位置處會(huì)顯藍(lán)色斑點(diǎn)。4、結(jié)果判斷如圖1-4所示，膜條的顯色結(jié)果，通過(guò)肉眼判斷，以各位點(diǎn)顯色信號(hào)的有無(wú)來(lái)判斷待檢樣品是否存在基因突變，以及若有基因突變，是突變純合子還是雜合子。在第一個(gè)示例中，如圖1所示，若尼龍膜條上所有正常對(duì)照探針對(duì)應(yīng)的位置都顯色，所有突變檢測(cè)探針對(duì)應(yīng)的位置都不顯色，則可判斷為該檢測(cè)樣品未檢出突變，基因型可以簡(jiǎn)寫(xiě)為N/N。在第二個(gè)示例中，如圖2所示，若有一個(gè)突變檢測(cè)探針對(duì)應(yīng)的位置顯色，且所有的正常對(duì)照探針對(duì)應(yīng)的位置都顯色，則該樣品可判斷為突變雜合子，基因型可以簡(jiǎn)寫(xiě)為M/N，并在M前加上發(fā)生突變的位點(diǎn)，本例中，基因型為252M/N。在第三個(gè)示例中，如圖3所示，若有一個(gè)突變檢測(cè)探針對(duì)應(yīng)的位置顯色，且其相對(duì)應(yīng)的正常對(duì)照探針對(duì)應(yīng)的位置不顯色，其余的正常對(duì)照探針對(duì)應(yīng)的位置均顯色，則該樣品可判斷為突變純合子，基因型可以簡(jiǎn)寫(xiě)為M/M，并在兩個(gè)M前都加上發(fā)生突變的位點(diǎn)，本例中，基因型為356M/356M。在第四個(gè)示例中，如圖4所示，若有兩個(gè)突變檢測(cè)探針對(duì)應(yīng)的位置顯色，且所有的正常對(duì)照探針對(duì)應(yīng)的位置都顯色，則該樣品可判斷為雙重突變雜合子，基因型也可以簡(jiǎn)寫(xiě)為M/M，并在兩個(gè)M前分別加上兩個(gè)突變位點(diǎn)(不分先后)，本例中，基因型為413M/356M。本發(fā)明實(shí)施例中的以上所述4種情況為絕大多數(shù)病例可能出現(xiàn)的情況，若結(jié)果超出上述4種情況，在確認(rèn)實(shí)驗(yàn)操作無(wú)誤的情況下，應(yīng)每個(gè)病例具體分析結(jié)果。針對(duì)中國(guó)人中最常見(jiàn)的9種PAH基因突變類(lèi)型，通過(guò)將含有9種PAH基因突變位點(diǎn)的突變檢測(cè)探針固定在膜條上，與待檢者相應(yīng)DNA片段的PCR產(chǎn)物雜交，可同時(shí)檢測(cè)PAH基因突變的這9種突變類(lèi)型：R111X、R176X、EX6-96A>G、R241C、R243Q、R252Q、Y356X、V399V、R413P。本發(fā)明是基于PCR-膜條雜交技術(shù)的基因檢測(cè)方法，能直接對(duì)待檢者的基因型進(jìn)行確診，具有準(zhǔn)確性高、特異性強(qiáng)，能檢出基因隱性攜帶者等優(yōu)點(diǎn)。因此，可以在婚檢或孕檢中使用該方法對(duì)準(zhǔn)父母進(jìn)行基因檢測(cè)，然后根據(jù)情況，必要時(shí)對(duì)胎兒進(jìn)行產(chǎn)前檢測(cè)，這樣就可以大大減少苯丙酮尿癥患兒的出生。本發(fā)明是基于PCR-反向點(diǎn)雜交技術(shù)的基因檢測(cè)方法，能直接對(duì)待檢者的基因型進(jìn)行確診，具有準(zhǔn)確性高、特異性強(qiáng)，能檢出基因隱性攜帶者等優(yōu)點(diǎn)。用本方法進(jìn)行檢測(cè)不需要貴重的專(zhuān)用儀器，只需要PCR實(shí)驗(yàn)室常規(guī)的設(shè)備即可，適用于在國(guó)內(nèi)醫(yī)院大范圍推廣使用。以上內(nèi)容是結(jié)合具體的優(yōu)選實(shí)施方式對(duì)本發(fā)明所作的進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明，不能認(rèn)定本發(fā)明的具體實(shí)施只局限于這些說(shuō)明。對(duì)于本發(fā)明所屬
技術(shù)領(lǐng)域：
的普通技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，在不脫離本發(fā)明構(gòu)思的前提下，做出若干等同替代或明顯變型，而且性能或用途相同，都應(yīng)當(dāng)視為屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。序列表<110>深圳市億立方生物技術(shù)有限公司<120>用于診斷PAH基因突變的雜交膜條、PCR引物及試劑盒<130>17A100034JYC<160>28<210>1<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>1gagctttcatgagataagaa20<210>2<211>16<212>DNA<213>人工序列<400>2gcccatcccttgagtg16<210>3<211>18<212>DNA<213>人工序列<400>3attgtactcacagcaagc18<210>4<211>16<212>DNA<213>人工序列<400>4ggtttctgcctccgac16<210>5<211>16<212>DNA<213>人工序列<400>5acaggttggaggcgga16<210>6<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>6aagaaatcctgagaggaaag20<210>7<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>7gcctacagtaatgcttatca20<210>8<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>8tcacctaactttctccttgg20<210>9<211>18<212>DNA<213>人工序列<400>9cttctcagttccctacga18<210>10<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>10gagctttcacgagataagaa20<210>11<211>16<212>DNA<213>人工序列<400>11catccctcgagtggaa16<210>12<211>18<212>DNA<213>人工序列<400>12tgtactcatagcaagcat18<210>13<211>15<212>DNA<213>人工序列<400>13tggtttccgcctccg15<210>14<211>15<212>DNA<213>人工序列<400>14cacaggtcggaggcg15<210>15<211>18<212>DNA<213>人工序列<400>15gaaatcccgagaggaaag18<210>16<211>19<212>DNA<213>人工序列<400>16ggcctacagtactgcttat19<210>17<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>17ctcaccttactttctccttg20<210>18<211>18<212>DNA<213>人工序列<400>18ttctcagttcgctacgac18<210>19<211>17<212>DNA<213>人工序列<400>19gctagcctgcctgctct17<210>20<211>21<212>DNA<213>人工序列<400>20gaagacagtgtggagttactt21<210>21<211>18<212>DNA<213>人工序列<400>21acccctgcttgagacacc18<210>22<211>19<212>DNA<213>人工序列<400>22catggaagccacagtactt19<210>23<211>19<212>DNA<213>人工序列<400>23gatgcgtcaaagcctatgt19<210>24<211>19<212>DNA<213>人工序列<400>24atgaacccaaacctcattc19<210>25<211>17<212>DNA<213>人工序列<400>25atagggatgcagcaggg17<210>26<211>19<212>DNA<213>人工序列<400>26accacccacagatgagtgg19<210>27<211>19<212>DNA<213>人工序列<400>27cggcttcactcaagcctgt19<210>28<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>28gatggtagggaaagacagtc20當(dāng)前第1頁(yè)1 2 3