一種穗菝葜的種質資源鑒定方法與流程

本發(fā)明涉及分子標記技術領域，特別涉及植物種質資源鑒定中引物組的開發(fā)和應用，通過轉錄組測序的方法，高效開發(fā)了47對特異性強、靈敏度佳的ssr引物，以歐洲、亞洲、非洲產的穗菝葜植物資源為材料，覆蓋其自然分布區(qū)，以此建立穗菝葜植物的ssr遺傳信息特征庫和種質資源鑒定框架，并進行快速種質資源鑒定的方法。

背景技術：

穗菝葜(smilaxasperalinnaeus，英文名italiansarsaparilla、roughbindweed)為菝葜科菝葜屬多年生攀援藤本或小灌木，廣布于歐洲地中海地區(qū)、非洲東部、亞洲南部地區(qū)，我國產于云南(西南部)和西藏(聶拉木、吉隆等地)。經國內外學者研究發(fā)現(xiàn)穗菝葜植株各部位具有潛在藥用及經濟價值：其葉提取物富含維他命e族(α生育酚、β生育酚、γ生育酚)抗氧化物；其漿果提取物富含花青素(矢車菊素-3-o-蘆丁糖甙、天竺葵素-3-o-蘆丁糖苷)，可作為天然色素良好來源；其根部提取物含有呋甾皂苷、甾體皂苷、菝葜皂苷、白藜蘆醇、反式白藜蘆醇等成分，有抗炎、抗真菌、抗麻風等活性，具有鎮(zhèn)痛、利尿、發(fā)汗、滋補、凈化等功效；穗菝葜的根部提取物也是生產沙士飲料的原料之一，該類型產品占臺灣碳酸飲料市場三成以上。雖然在研究和應用領域越來越受到關注，但由于其分布范圍廣，橫跨歐洲、非洲、亞洲三個大陸，不同地區(qū)種質資源在有效成分和遺傳物質上存在差異，如能有效甄別穗菝葜的種質資源類型，將給后續(xù)植物資源的合理利用和開發(fā)帶來便利。

ssr分子標記作為一項方法成熟、操作快捷、結果可靠的技術已廣泛用于植物的種質資源鑒定。邱楊等(植物遺傳資源學報2014，15(3)：648-654)利用ssr分子標記技術對75份不同來源的蘿卜樣本進行了種質資源鑒定，并建立了分子身份證；王瑞等(中國農學通報2016，32(34)：135-142)利用ssr分子標記技術對南瓜的不同品種進行了種質資源分析，將南瓜分為中國南瓜、印度南瓜及美洲南瓜3個類群。

目前雖然已有報道對穗菝葜進行分子標記開發(fā)的案例，但無論是實施方案和可行性方面，都存在不足。xu等(americanjournalofbotany:e64–e66.2011)通過雙重抑制法開發(fā)了少量穗菝葜ssr引物，但該方法僅獲得了兩堿基重復單元或兩堿基重復組合單元類型的ssr標記，遺傳多樣性不高，位點覆蓋度不足，多態(tài)性豐富度低，且僅適用于希臘與意大利的穗菝葜植物群體，不能夠有效地鑒定不同種源穗菝葜。此外，該方法開發(fā)周期長，一次開發(fā)獲得引物通量低，單位標記成本相對較高。若通過dna基因片段對穗菝葜進行鑒定，從其鑒別效率看，該方法不能有效甄別區(qū)域內群體間的種質資源，通常標記來自于葉綠體單倍型，只能檢測單親母系遺傳的遺傳信息，而且如果對所有基因片段進行測序，其費用高昂，面對大批量樣本可實施性不佳。因此，需要開發(fā)出一種成本相對低廉，且能快速高效鑒定穗菝葜種質資源的方法。利用轉錄組數據設計開發(fā)的簡單重復序列(ssr)在技術和實施上都具有一定優(yōu)勢，相比于傳統(tǒng)的ssr分子標記開發(fā)方法，借助高通量測序技術批量開發(fā)ssr引物，可以獲得覆蓋面更廣、遺傳多樣性更高的位點，可更高效地鑒定物種種質資源，在已有的開發(fā)案例中，weietal.(bmcgenomics2011,12:451)通過對芝麻花組織的轉錄組測序，批量開發(fā)ssr引物，有效用于油用經濟作物芝麻的種質資源鑒定。本發(fā)明通過利用穗菝葜的轉錄組信息批量開發(fā)ssr引物，從歐洲、亞洲、非洲各地的大量穗菝葜野生群體獲取豐富的ssr遺傳多樣性信息，并建立穗菝葜種質資源ssr遺傳信息特征庫庫和種質資源鑒定框架，并進行快速鑒定，該方法技術成熟、實施流程便捷且鑒定效果明顯，將為后續(xù)穗菝葜植物資源的科學利用和開發(fā)提供便利。

參考文獻：

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邱楊,李錫香,李清霞,陳亦辰,沈鏑,王海平,宋江萍,2014.利用ssr標記構建蘿卜種質資源分子身份證.植物遺傳資源學報15,648–654.

王瑞,吳廷全,鐘玉娟,黃河勛,2016.95份南瓜種質資源親緣關系的ssr分析.中國農學通報,135–142.

技術實現(xiàn)要素：

基于此，本發(fā)明的目的是提供一種利用ssr標記鑒定穗菝葜種質資源的方法。

具體技術方案如下：

一種穗菝葜種質資源鑒定的方法，包括以下步驟：

(1)提取待測樣品基因組dna；

(2)以步驟(1)提取的dna為模板，用基于穗菝葜轉錄組序列的ssr引物組合進行pcr擴增；

(3)對步驟(2)所得不同長度的擴增產物進行測序，通過geneious9.0.2軟件進行等位基因的讀取，形成等位基因矩陣；

(4)對步驟(3)所得到的等位基因矩陣利用cervus3.0軟件計算等位基因數(a)、觀察與期望雜合度(ho、he)、多態(tài)性信息量(pic)；

(5)對步驟(3)所得到的等位基因矩陣利用genalex6.5軟件進行ssr引物(位點)基于不同群體的等位基因的統(tǒng)計和列舉，形成穗菝葜種質資源ssr遺傳信息特征庫，并選取隨機樣本進行驗證；

(6)對步驟(3)所得到的等位基因矩陣利用genalex6.5軟件生成遺傳距離矩陣，并通過mega6軟件進行遺傳距離聚類分析，構建upgma樹，建立穗菝葜種質資源鑒定框架；

(7)隨機盲選10份穗菝葜樣本，利用相同47對ssr引物pcr擴增，得到等位基因數據，加入到上述構建穗菝葜種質資源鑒定的等位基因矩陣中，通過遺傳距離聚類分析評估與鑒定10份樣本種質資源狀況與來源。

該方法能夠對來自歐洲、非洲、亞洲的不同產地，及地區(qū)內不同自然群體來源的穗菝葜進行有效、快速的分類和鑒定，結果準確可靠，該方法簡單易行，適用性高，可有效運用于穗菝葜的種質資源鑒定。

其中，步驟(2)所述引物組合包括下述47對ssr引物，每對ssr引物由上游引物和下游引物組成，每對引物的核苷酸序列分別為seqidno.1-seqidno.2、seqidno.3-seqidno.4、seqidno.5-seqidno.6、seqidno.7-seqidno.8、seqidno.9-seqidno.10、seqidno.11-seqidno.12、seqidno.13-seqidno.14、seqidno.15-seqidno.16、seqidno.17-seqidno.18、seqidno.19-seqidno.20、seqidno.21-seqidno.22、seqidno.23-seqidno.24、seqidno.25-seqidno.26、seqidno.27-seqidno.28、seqidno.29-seqidno.30、seqidno.31-seqidno.32、seqidno.33-seqidno.34、seqidno.35-seqidno.36、seqidno.37-seqidno.38、seqidno.39-seqidno.40、seqidno.41-seqidno.42、seqidno.43-seqidno.44、seqidno.45-seqidno.46、seqidno.47-seqidno.48、seqidno.49-seqidno.50、seqidno.51-seqidno.52、seqidno.53-seqidno.54、seqidno.55-seqidno.56、seqidno.57-seqidno.58、seqidno.59-seqidno.60、seqidno.61-seqidno.62、seqidno.63-seqidno.64、seqidno.65-seqidno.66、seqidno.67-seqidno.68、seqidno.69-seqidno.70、seqidno.71-seqidno.72、seqidno.73-seqidno.74、seqidno.75-seqidno.76、seqidno.77-seqidno.78、seqidno.79-seqidno.80、seqidno.81-seqidno.82、seqidno.83-seqidno.84、seqidno.85-seqidno.86、seqidno.87-seqidno.88、seqidno.89-seqidno.90、seqidno.91-seqidno.92、seqidno.93-seqidno.94，所述引物編號為奇數的核苷酸序列為上游引物，引物編號為偶數的核苷酸序列為下游引物；所述pcr擴增所用到的引物還包括一個5’端用熒光標記的通用引物，所述通用引物的序列為seqidno.95；

其中，步驟(2)中所述基于轉錄組序列的ssr引物組合是由以下方法篩選得到：搜索轉錄組數據中的ssr位點，針對ssr位點設計、開發(fā)并且合成目標引物，對所合成的引物進行最適退火溫度的篩選和通用性檢測，對篩選得到的引物進行pcr擴增，再對擴增產物通過毛細管電泳與geneious9.0.2軟件進行等位基因的讀取，確定用于穗菝葜種質資源鑒定的引物組合。

其中，ssr位點的搜索限制條件為：單堿基、二堿基、三堿基、四堿基、五堿基、六堿基重復單元的ssr區(qū)域，篩選相應重復次數至少為10次、6次、5次、4次、3次、3次，若兩個相鄰ssr之間的堿基距離小于100bp則視為復合型ssr。

其中，設計目標引物的參數為：產物長度18-27bp，退火溫度(tm)50-65℃，gc含量為50％-60％，產物長度100-500bp。

本發(fā)明的發(fā)明人通過大量的創(chuàng)造性試驗，開發(fā)出一套利用基于轉錄組的ssr標記鑒定穗菝葜種質資源的數據庫與方法，上述引物具有擴增穩(wěn)定、遺傳多態(tài)性高的優(yōu)點，能準確鑒定來自歐洲、非洲以及亞洲不同來源穗菝葜，將為后續(xù)穗菝葜植物資源合理開發(fā)利用奠定基礎。

本發(fā)明提供的利用ssr標記鑒定穗菝葜種質資源的方法，結果準確、可靠；可直接以植物新鮮或干燥組織為檢測樣品，快捷方便；通過遺傳聚類分析進行判斷，結果較為直觀。本發(fā)明的方法鑒定易行、適用于穗菝葜種質資源鑒定。

一般性定義

術語“ssr”即簡單重復序列，是一類由幾個核苷酸(一般為1～6個)為重復單位組成的長達幾十個核苷酸的串聯(lián)重復序列，其廣泛且均勻分布于真核生物染色體中，因其重復單元的數目存在高度變異，且ssr的側翼序列相對保守，是一種理想的分子標記技術。

術語“轉錄組”是指在某一生理條件下，某一組織細胞內所有轉錄產物的集合，對于同一個體，其不同生長時期、不同組織部位的轉錄組往往是不同的。

術語“引物”是指一小段單鏈的核苷酸序列，與目標片段側翼互補，用于pcr擴增時作為多核苷酸延伸的出發(fā)點。

術語“測序分型”是指通過測序儀，借助產物中的熒光信號來讀取一對等位基因的堿基長度。

術語“基因矩陣”是指個體相對于ssr引物(位點)的等位基因長度的陣列集合，用于遺傳參數的計算。

術語“種質資源”又稱遺傳資源，是指親代傳遞給子代的遺傳信息，對于同一物種來講，由于不同的生態(tài)環(huán)境影響，在長期的演化進程中，來自不同地理分布的該物種在相應的基因座上存在遺傳差異，通過分子標記技術能夠檢測到該差異，并對不同來源個體進行鑒定。

術語“種質資源鑒定框架”是指由mega6軟件生成的基于測試穗菝葜樣本的基因矩陣的upgma遺傳聚類樹，用于后續(xù)樣本的種質資源鑒定。

術語“穗菝葜ssr遺傳信息特征庫”是指ssr引物(位點)在所有測試穗菝葜樣本的等位基因長度的集合。

附圖說明

圖1為穗菝葜種質資源鑒定遺傳聚類框架圖；

圖2為10份穗菝葜樣本鑒定鑒定效果圖(用方框標注的分支表示盲選的穗菝葜樣本)。

具體實施方式

以下將結合具體實施例對本發(fā)明做進一步的闡述。

實施例中所用到的穗菝葜材料如下：

(1)用于構建穗菝葜種質資源鑒定框架的穗菝葜樣本：共12個群體，每個群體6個個體，總計72份植物材料，具體樣品信息見表1。

表1穗菝葜樣本信息一覽

(2)用于驗證的穗菝葜樣本：在上述群體中，隨機挑選10份穗菝葜樣本。

實施例1.構建穗菝葜轉錄組數據庫

(1)使用rnapreppureplantkit(北京天根)試劑盒進行穗菝葜新鮮葉片總rna提取，送測序公司進行轉錄組測序。

(2)利用geneious9.0.2的denovoassembly功能將短讀長序列拼接成轉錄組框架數據，取每條基因中最長的轉錄本作為unigene，建立能夠進行微衛(wèi)星位點檢索的轉錄組數據庫。

實施例2.微衛(wèi)星ssr引物的開發(fā)

(1)利用misa(http://pgrc.ipk-gatersleben.de/misa/misa.html)軟件對上述unigene進行不同類型微衛(wèi)星掃描，以識別和定位ssr位點，參數設置(misa.ini配置文件)如下：識別單核苷酸、二核苷酸、三核苷酸、四核苷酸、五核苷酸、六核苷酸的重復次數至少為10次、6次、5次、4次、3次、3次，若兩個相鄰ssr之間的堿基距離小于100bp則視為復合型ssr。

(2)將*.fasta、misa.pl和misa.ini都復制到同一文件夾目錄下，在perl環(huán)境下運行命令>misa.pl*.fasta，運行后得到*.fasta.misa和*.fasta.statistics兩個文件，其中*.fasta.misa用于后續(xù)的引物設計。

(3)在perl環(huán)境下利用primer3模塊批量設計ssr引物，引物設計參數為引物長度18-27bp，tm設置為50-65℃，gc含量為50％-60％，產物長度100-500bp。將p3_in.pl和p3_out.pl以及primer3_core復制到同一目錄下。

(4)運行p3_in.pl，命令為>p3_in.plc.fasta.misa，得到文件名為*.fasta.p3in的輸入文件；perl環(huán)境下運行primer3_core，命令為>primer3_core<*.fasta.p3in>*.fasta.p3out，產生文件*.fasta.p3out；最后運行p3_out.pl，命令為>p3_out.pl*.fasta.p3out*.fasta.misa，運行后得到*.fasta.results文件，獲得符合標準批量引物信息。

(5)根據不同的ssr重復，從穗菝葜ssr引物庫中隨機挑選153對引物(ssr重復單元涵蓋單堿基、二堿基、三堿基、四堿基、五堿基、六堿基和復合型型ssr)，上游引物5’端拼接m13序列，下游引物不變，共合成153對ssr引物。

實施例3.基因組dna提取

使用plantzol(杭州萊楓)試劑，采取改良的ctab法，提取上述72份穗菝葜材料的基因組dna，用nanodrop2000(thermofisherscientific，usa)定量后，稀釋到20ng/μl，4℃或-20℃保存待用。

實施例.ssr引物篩選和通用性檢測

(1)以上述穗菝葜樣本中群體編號為il的一個個體dna為模板，對合成的ssr引物進行最適退火溫度的篩選。

pcr反應體系為：模板dna20ng，上下游引物各0.2μm，2×mastermix(杭州擎科，下同)5μl，反應體積為10μl，用ddh2o補足體積。

pcr反應為：94℃預變性5min，緊接著35個循環(huán)的94℃變性45s，50-65℃(溫度梯度)退火45s，72℃延伸1min，最后保持72℃延伸5min。產物用2％的瓊脂糖進行電泳檢測，挑選有擴增條帶并且條帶單一的引物，確定該引物擴增條帶最亮時的退火溫度為其最適退火溫度。

(2)從上述穗菝葜樣本中每個群體挑選一個個體，共12個個體，對上述步驟中篩選到的ssr引物進行通用性檢測。

pcr反應體系為：模板dna20ng，上下游引物各0.2μm，2×mastermix5μl，反應體積為10μl，用ddh2o補足體積。

pcr反應程序為：94℃預變性5min，緊接著35個循環(huán)的94℃變性45s，tm(見表2)退火45s，72℃延伸1min，最后保持72℃延伸5min。產物用2％的瓊脂糖進行電泳檢測，挑選至少在75％的個體中都有單一明亮條帶的引物，作為穗菝葜種質資源鑒定的候選引物。

(3)綜合以上2步，從合成的153對ssr引物中篩選得到64對候選ssr引物。

實施例5.ssr引物的群體擴增

(1)以全部72份穗菝葜樣本dna為模板，采用“三引物”、“兩步走”的擴增策略進行pcr擴增，“三引物”包括一個上游引物、一個下游引物和一個5’端用熒光標記(fam、hex、tamra或rox)的通用m13引物，所述上游引物為在步驟2合成的5’端拼接有5’-cacgacgttgtaaaacgac-3’(m13)序列的上游引物，所述下游引物為步驟2合成的下游引物。拼接有“m13”的上游引物擴增后，為通用m13引物提供了反向互補序列，m13引導的pcr擴增產生帶有熒光的pcr產物?！皟刹阶摺奔磒cr反應過程采取前后兩步不同條件的程序，使熒光pcr產物更有效地擴增。整個pcr擴增反應過程的引物用量比例為ssr上游引物：ssr下游引物：m13通用熒光引物＝1:4:4。

(2)第一步擴增：dna模板20ng，上游引物0.1μm，下游引物0.4μm，2×mastermix5μl，反應體積為10μl，用ddh2o補足體積。反應程序為：94℃預變性5min，緊接著35個循環(huán)的94℃變性45s，tm(見表2)退火45s，72℃延伸1min，最后保持72℃延伸5min。

(3)第二步擴增：以第一步的擴增產物為模板，繼續(xù)加入0.8μl(5μm)的m13通用熒光引物，5μl的2×mastermix，反應體積20μl，用ddh2o補足體積。反應程序為94℃預變性3min，緊接著20個循環(huán)的94℃變性30s，53℃退火30s，72℃延伸45s，最后保持72℃延伸10min。得到帶有熒光信號的pcr擴增產物。

實施例6.穗菝葜種質資源鑒定框架和ssr遺傳信息特征庫的構建

(1)按照不同長度和不同熒光的pcr反應產物等比例混合，用3730xldna測序儀(abi，usa)進行毛細管電泳，用geneious9.0.2軟件進行等位基因分型的判別和讀取，形成等位基因矩陣。選擇峰型較好，峰高大于200，且條帶長度較好的，在所設計引物的擴增產物大小區(qū)間的作為有效引物。

(2)將上述步驟得到的等位基因矩陣利用cervus3.0軟件計算等位基因數(a)、觀察與期望雜合度(ho、he)、多態(tài)性信息量(pic)，見表2；選擇pic值大于0.2的引物，用于構建穗菝葜種質資源鑒定框架和ssr遺傳信息特征庫，共有47對引物符合條件，每對引物由上游引物和下游引物組成，見表3。

表2基于穗菝葜轉錄組的ssr引物的最適退火溫度及遺傳參數

表3基于穗菝葜轉錄組開發(fā)的47對ssr引物及m13通用引物序列

(3)利用genalex6.5軟件對等位基因矩陣進行ssr引物(位點)基于12個穗菝葜自然群體的等位基因片段長度的統(tǒng)計和列舉，形成穗菝葜種質資源ssr遺傳信息特征庫，見表4。

表4穗菝葜種質資源ssr遺傳信息特征庫(單位：bp,0表示缺失)

(4)利用genalex6.5軟件對等位基因矩陣生成遺傳距離矩陣，并通過mega6軟件進行遺傳距離聚類分析，構建upgma樹，建立穗菝葜種質資源鑒定框架，見附圖1。

附圖1清晰地展示了72個不同穗菝葜樣本的遺傳聚類關系，來自同一群體的6個個體能夠聚類到一個分支(sm-6、gc-2聚類到相鄰群體內)。不同地理分布的群體能夠清晰地分辨，upgma樹分為2大支，一支為歐洲地中海支系，另一支為東非-南亞支系；同時2大支系內的穗菝葜群體也都按照不同的地理分布清晰地聚類，2大支系內的穗菝葜的遺傳距離與地理距離一致，穗菝葜種質資源遺傳距離鑒定框架可靠。

實施例7.穗菝葜種質資源鑒定的驗證

(1)通過ssr遺傳信息特征庫進行鑒定

隨機盲選穗菝葜樣本10份(除去構建穗菝葜種質資源鑒定框架的個體)，分別標記為x-1～x-10,按照步驟3提取基因組dna，按照步驟5的pcr過程進行產物擴增，用geneious9.0.2軟件進行等位基因分型的判別和讀取，具體信息見表6。

表6驗證樣本基于47對ssr引物的等位基因分型表(單位：bp，0表示缺失)

將驗證樣本的等位基因分型逐一與穗菝葜種質資源ssr遺傳信息特征庫進行比對，通過少于47對引物的組合，可以將驗證樣本定位到某一群體。通過該方法對10個隨機抽樣個體進行檢測，對其群體尺度進行定位，鑒定效果見表7。

表7驗證樣本基于穗菝葜種質資源ssr遺傳信息特征庫的群體定位效果

通過對10個驗證樣本進行群體定位，其中5個樣本完全符合其真實群體信息，成功率為50％，另5個樣本定位到包含其真實群體和鄰近群體的兩個群體中，這可能是相鄰地理距離的群體間遺傳差異較小造成的，通過此法能夠對穗菝葜樣本進行初步鑒定。

(2)通過穗菝葜種質資源鑒定框架進行鑒定

對上述的10個穗菝葜樣本，用47對ssr引物按照步驟5和步驟6進行等位基因分型。將等位基因矩陣加入到步驟6中的穗菝葜種質資源鑒定框架中，利用mega6軟件進行聚類，構建upgma遺傳距離樹(見附圖2)，分析鑒定效果。

鑒定效果分析，查找x-1～x-10的來源信息，具體信息見表8。

表8驗證樣本信息及驗證效果統(tǒng)計表

經過鑒定效果統(tǒng)計，10份樣本中，有7份樣本是能夠準確鑒定其群體來源，成功率為70％；另外3份樣本也未遠離其真實群體，其遺傳距離聚類與其真實群體靠近。

綜上所述，采用上述(1)(2)兩種鑒定方法組合的方式，被鑒定樣本準確率將提升至70％，同時未能確定具體群體來源的樣本也被鑒定到與其真實群體地理相鄰的群體。說明本發(fā)明基于穗菝葜轉錄組開發(fā)的47對ssr引物組合、ssr遺傳信息特征庫、種質資源鑒定框架及兩種鑒定方式能夠有效確定穗菝葜樣本的種質資源來源，將能有效地應用于未知樣本的鑒定，同時本發(fā)明的方法快捷，結果準確、可靠，可為將來穗菝葜植物的種質資源鑒定帶來便利。

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<210>15

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<400>15

aagccaagcaaacccattta

<210>16

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<400>16

caccctctgactccgaagag

<210>17

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<400>17

cagggagttggtcctcaaaa

<210>18

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<400>18

atggttgcaaagaaacaccc

<210>19

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<400>19

ctaaggcgatatcctcagcg

<210>20

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<400>20

cagccacttggtatccacct

<210>21

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<400>21

aagggacatttttgttcccc

<210>22

<211>24

<212>dna

<213>人工序列

<400>22

gcaagttaagcaacacagttaagg

<210>23

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<400>23

agatccacagttccacctgc

<210>24

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<400>24

gcgcttgatgtgctcaaata

<210>25

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<400>25

gatctgggtttctcgttgga

<210>26

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<400>26

ggccatttggaagagactga

<210>27

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<400>27

gagatttccagcaaaaccca

<210>28

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<400>28

agtttctgggccctctgtct

<210>29

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<400>29

ccatggtggacgactttctt

<210>30

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<400>30

gcatggaaacgcctatgatt

<210>31

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<400>31

cttggcaacaccaatcaatg

<210>32

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<400>32

tgcacgtgatcactggatct

<210>33

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<400>33

catttcgatgaatcgtgtgg

<210>34

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<400>34

gtagggttcggtgctgatgt

<210>35

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<400>35

tcgatttccacccatttctc

<210>36

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<400>36

gctgagtacttgagggcgtc

<210>37

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<400>37

cagtgcctcttccttgcttc

<210>38

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<400>38

tatacccaggtctccgaacg

<210>39

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<400>39

atttcgccactaccttgcac

<210>40

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<400>40

atccttcattcaatgccgag

<210>41

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<400>41

ggactggattccgttttgct

<210>42

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<400>42

agccaggacattgcctttac

<210>43

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<400>43

tgttgggtgagcaaaacaaa

<210>44

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<400>44

acctttctccccacttgctt

<210>45

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<400>45

taattggcttcggattgacc

<210>46

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<400>46

ggaattcgttcttccccatt

<210>47

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<400>47

ggacttggtcatcaggtcgt

<210>48

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<400>48

ttgtgcaaccaaactccaga

<210>49

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<400>49

cacaagcttgatgaggtcca

<210>50

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<400>50

aaggacacggaccatgaaag

<210>51

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<400>51

agcagccttgggcttatttt

<210>52

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<400>52

ttctgttgtgcggatattgg

<210>53

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<400>53

gaagggagggaggagaagtg

<210>54

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<400>54

ccgtttaaagatcccgtcaa

<210>55

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<400>55

tgctggaagaacaacgactg

<210>56

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<400>56

gttaccgttggtcacctgct

<210>57

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<400>57

tggattcatgtgtttggctg

<210>58

<211>22

<212>dna

<213>人工序列

<400>58

aaatcaggcctcctcattgtaa

<210>59

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<400>59

caccttctcctcctcttccc

<210>60

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<400>60

tcatctcccctcttcttccc

<210>61

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<400>61

ctggagatctcaccctctcg

<210>62

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<400>62

caatgagacagtccggatca

<210>63

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<400>63

aattgggatttgatgatcgc

<210>64

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<400>64

ccaaaaacccacgagagaaa

<210>65

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<400>65

gctggtacttcttcttgccg

<210>66

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<400>66

acttcgagaacagcctccaa

<210>67

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<400>67

cccttctctcctcccatttc

<210>68

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<400>68

acgctgatgacctgcttctt

<210>69

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<400>69

tcacgtgtgaggttctagcg

<210>70

<211>18

<212>dna

<213>人工序列

<400>70

tggcgtcccagtgagtgt

<210>71

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<400>71

acgtaactctcggtgccatc

<210>72

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<400>72

cgtgtggaagggaggtaaaa

<210>73

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<400>73

atgacatcccctccctctct

<210>74

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<400>74

ccccaccattgtcttgaagt

<210>75

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<400>75

aggccaagactatcagcgaa

<210>76

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<400>76

tctttcttgctccaggcatt

<210>77

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<400>77

gggaacactaccttctgcca

<210>78

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<400>78

ttgagatctggggaggtttg

<210>79

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<400>79

tgtggtgcttgatgagcttc

<210>80

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<400>80

cgttgcacagagcgaataaa

<210>81

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<400>81

cttctccgcataccacctgt

<210>82

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<400>82

gctctgcgtctgttccattt

<210>83

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<400>83

atgcttgacacgcttgattg

<210>84

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<400>84

agctgcttggacagcaaaat

<210>85

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<400>85

acggtctctttcaagaaggg

<210>86

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<400>86

gatgaaggagaacgcaaagc

<210>87

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<400>87

gagagcccacgtgaagtgat

<210>88

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<400>88

ccccataaatgtgggagatg

<210>89

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<400>89

gcaaagctcttctcctccct

<210>90

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<400>90

ctggatggctttggatagga

<210>91

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<400>91

gaccccatggatacgagaac

<210>92

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<400>92

ctaaacccgactccccaaat

<210>93

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<400>93

agaaccagcagagcgacatt

<210>94

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<400>94

ttgcgtcagcttacccttct