κ?酪蛋白來源生物活性肽的制備和應(yīng)用的制作方法

本申請是原申請的分案申請，原申請的申請日為：2014.12.09；申請?zhí)枮椋?014108094134；發(fā)明創(chuàng)造名稱為：κ-酪蛋白的生物活性多肽及其制備和應(yīng)用。

本發(fā)明涉及蛋白領(lǐng)域，具體涉及多種來源于κ-酪蛋白的生物活性多肽及其制備和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

由于生物活性肽作為促進健康的生物活性成分，具有傳遞生理信息，調(diào)節(jié)生理功能的作用，對于人體的神經(jīng)、消化、生殖、生長、運動、代謝、循環(huán)等系統(tǒng)的正常生理活動的維持非常重要。它們不僅具有抗病毒、細菌、抗高血壓、降膽固醇等作用，而且作為免疫調(diào)節(jié)劑具有調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)、抗腫瘤等功能；能夠清除自由基具有延緩衰老的功效，是當前國際食品界最熱門的研究課題和極具發(fā)展前景的功能因子。各種活性肽常作為功能食品添加成分用于食品的實踐生產(chǎn)，特別是在乳飲料、食品添加劑的應(yīng)用方面已經(jīng)取得良好效果。乳源性生物活性肽生物的功能及對消費者的健康的影響正備受重視。

近年來，越來越多的科學研究表明很多來源于生物蛋白的小肽具有多種生物學活性，如激素作用、免疫調(diào)節(jié)、抗血栓、抗高血壓、降膽固醇、抑菌、抗病毒、抗癌作用等。同時，研究發(fā)現(xiàn)小肽可以被人體更好地吸收和利用，改變了傳統(tǒng)的蛋白質(zhì)只能被降解成氨基酸才能被吸收利用的觀點。在眾多生物蛋白中各種牛乳蛋白是非常重要的生物活性多肽來源之一，它們被乳酸菌分解利用，并發(fā)生了一系列生理生化反應(yīng)，使蛋白質(zhì)變?yōu)槎嚯幕蛘哂坞x的氨基酸，最終被人體消化吸收或通過小腸上皮細胞的吸收轉(zhuǎn)運直接進入人體的血液循環(huán)，發(fā)揮其生物活性作用。

因此，這些生物活性小肽不僅成為篩選藥物的天然資源寶庫，也是功能性食品工業(yè)的主要原料成分。目前，生物活性肽的制備及其應(yīng)用開發(fā)已經(jīng)成為世界范圍內(nèi)研究的熱點。

免疫活性肽是繼阿片肽發(fā)現(xiàn)后首次從乳中獲得并證明其生理活性的一類生物活性肽。1981年，jolles等人首次發(fā)現(xiàn)，利用胰蛋白酶水解人乳蛋白，從水解物中得到一種免疫活性肽段，其氨基酸序列為val-glu-pro-ile-pro-tyr，該短肽被證明在體外實驗中能夠增強小鼠腹腔巨噬細胞對綿羊血紅細胞的吞噬作用，靜脈注射，則能增強小鼠對肺炎克氏桿感染的抵抗能力。elitsur等人經(jīng)胃蛋白酶處理酪蛋白得到arg-tyr-leu-gly-tyr-leu-glu和arg-tyr-leu-gly-tyr-leu，研究證明該兩短肽不僅具有阿片樣活性，也具有免疫調(diào)節(jié)活性，可增強淋巴細胞增殖，提高自然殺傷細胞(nk)能力，促進噬中性白細胞的移動。張少輝等人利用瑞士乳桿菌發(fā)酵脫脂乳獲得了生物活性多肽qepvl及其降解產(chǎn)物qepv，經(jīng)過體外抗氧化實驗、體外免疫功能促進實驗，驗證了多肽qepv具有較好的抗氧化生物學活性和促進細胞免疫的活性，一方面能夠清除機體內(nèi)的自由基，減少自由基對人體的傷害；另一方面，生物活性多肽qepvl和qepv還能夠增強機體免疫力，增強淋巴細胞、巨噬細胞的增殖能力，使巨噬細胞一氧化氮誘生量增加，并促巨噬細胞分泌細胞因子。

盡管牛乳蛋白內(nèi)隱含有許多具有生物活性的肽序列，但這些生物活性肽序列只有通過一定的手段將其釋放出來才能發(fā)揮作用。獲取乳蛋白源活性肽的主要手段有兩種：發(fā)酵，利用微生物(乳酸菌)發(fā)酵乳源蛋白獲?。幻附?，包括來自動物的消化道酶和來自植物和微生物的蛋白酶。

研究結(jié)果表明乳源性生物活性肽作為一類小分子物質(zhì)，以其分子量低、活性強、用量少的獨特優(yōu)勢，已越來越多的引起人們的重視。所以它們不僅僅作為功能性食品原料用于各種功能性食品的制造，而且作為免疫調(diào)節(jié)劑具有調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)、抗腫瘤等功能；能夠清除自由基具有延緩衰老的功效。此外，多數(shù)乳源性生物活性肽能夠抵抗胃腸道的消化，在小腸內(nèi)以完整的形式被機體吸收，而不必被分解成單個氨基酸，具有易消化吸收，食用安全性極高。因此乳源性生物活性肽的能夠提高機體抵御外界不良因素的刺激、降低機體發(fā)病率等功能特性備受重視，有望成為具有清除自由基、減少患癌幾率和延緩衰老的非藥物性物質(zhì)原料，在功能性食品和醫(yī)藥領(lǐng)域具有非常廣闊的應(yīng)用前景，今后必將成為國際食品界和生物醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)界的最熱門的研究課題，為提高人類健康水平、不得病或者說少得病、延緩衰老、延長壽命發(fā)揮重要的作用。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供：

一種分離的生物活性多肽ntvpa，其包括

(a)由asn-thr-val-pro-ala(seqidno：1)所示的氨基酸組成的多肽；

(b)或在seqidno：1所示的氨基酸序列中經(jīng)取代、缺失或添加一個或幾個氨基酸且具有同等活性的由(a)衍生的多肽；

一種分離的生物活性多肽vvtil，其包括

(c)由val-val-thr-ile-leu(seqidno：2)所示的氨基酸組成的多肽；

(d)或在seqidno：2所示的氨基酸序列中經(jīng)取代、缺失或添加一個或幾個氨基酸且具有同等活性的由(c)衍生的多肽；

一種分離的生物活性多肽pkknq，其包括

(e)由pro-lys-lys-asn-gln(seqidno：3)所示的氨基酸組成的多肽；

(f)或在seqidno：3所示的氨基酸序列中經(jīng)取代、缺失或添加一個或幾個氨基酸且具有同等活性的由(e)衍生的多肽。

較優(yōu)的，所述生物活性多肽的來源為乳源性。

κ-酪蛋白的氨基酸序列為既有技術(shù)，具體氨基酸序列如seqidno:4所示：

metmetlysserphepheleuvalvalthrileleualaleuthrleuglyalaglnglu

glnasnglnglugluproileargcysglulysaspgluargphepheserasplysile

alalystyrileproileglntyrvalleuserargtyrprosertyrglyleuasntyrtyr

glnglnlysprovalalaleuileasnasnglnpheleuprotyrprotyrtyralalys

proalaalavalargserproalaglnileleuglntrpglnvalleuserasnthrval

proalalyssercysglnalaglnprothrthrmetalaarghisprohisprohisleu

serphemetalaileproprolyslysasnglnasplysthrgluileprothrileasn

thrilealaserglygluprothrserthrserthrprothrthrgluserthrvalleu

glyaspserprogluvalilegluserproprogluileasnthrvalglnvalthrser

thralaval。

本發(fā)明的生物活性多肽ntvpa為乳源性，具體來源于κ酪蛋白，并且為κ酪蛋白(seqidno:4)第102～106位的氨基酸殘基。

本發(fā)明的生物活性多肽vvtil為乳源性，具體來源于κ酪蛋白(seqidno:4)第8～12位的氨基酸殘基。

本發(fā)明的生物活性多肽pkknq為乳源性，具體來源于κ酪蛋白(seqidno:4)第131～135位的氨基酸殘基。

較優(yōu)的，所述生物活性多肽ntvpa、vvtil、pkknq均具有體外抗氧化活性和增強機體免疫力的功能。

本發(fā)明的生物活性多肽ntvpa、vvtil、pkknq均可以通過基因工程的方法和化學方法人工合成，也可以從乳制品中通過分離純化、酶降解的方法獲得。

本發(fā)明還公開了編碼前述生物活性多肽ntvpa、vvtil、pkknq的核苷酸片段。

κ-酪蛋白的氨基酸序列以及核苷酸序列為既有技術(shù)，編碼κ-酪蛋白第102～106位氨基酸殘基的核苷酸片段能編碼成熟的生物活性多肽ntvpa，編碼κ-酪蛋白第8～12位氨基酸殘基的核苷酸片段能編碼成熟的生物活性多肽vvtil，編碼κ-酪蛋白第131～135位氨基酸殘基的核苷酸片段能編碼成熟的生物活性多肽pkknq。

本發(fā)明第二方面公開了前述生物活性多肽的制備方法，步驟如下：

1)發(fā)酵：將瑞士乳桿菌(lactobacillushelveticus)添加到脫脂乳中進行厭氧發(fā)酵，獲得瑞士乳桿菌發(fā)酵乳；

2)多肽的粗提：對步驟1)的瑞士乳桿菌發(fā)酵乳進行低溫離心分離，取上清液；

3)多肽的純化：

a.對步驟2)的上清液進行超濾處理，收集濾液；

b.固相萃取柱分離：收集的濾液采用waterssep-pakc18固相萃取柱萃取，收集生物活性多肽混合物；

4)多肽的消化及穩(wěn)定性：采用兩步酶解法酶解步驟3)的生物活性多肽混合物，獲得被消化后的生物活性多肽混合物；第一步酶解所采用的酶為胃蛋白酶，第二步酶解所采用的酶為胰酶。

本發(fā)明所述脫脂乳為經(jīng)過脫脂處理的牛乳，通常脫脂乳中脂肪含量小于0.1％。

較優(yōu)的，步驟1)中，瑞士乳桿菌為瑞士乳桿菌(lactobacillushelveticus，cicc6024)。

較優(yōu)的，步驟1)中，所述厭氧發(fā)酵的條件為：發(fā)酵溫度36～38℃，發(fā)酵培養(yǎng)6～8h；更優(yōu)選發(fā)酵溫度37℃，發(fā)酵培養(yǎng)7h。

較優(yōu)的，步驟2)中，所述低溫離心的條件為：4℃，8000～10000rpm，離心15～30min。

較優(yōu)的，步驟3)a中，所述超濾處理所采用的是截留分子量分別為3kda的超濾管。

更優(yōu)的，步驟3)a中，所述超濾處理過程中，轉(zhuǎn)速為4800r/min，時間為30min，離心溫度為4℃。

較優(yōu)的，步驟3)b中，固相萃取柱分離，具體方法為：活化和平衡waterssep-pakc18固相萃取柱；將步驟3)a中收集的濾液進行稀釋后上樣，采用洗脫液洗脫，收集所得到的洗脫液，即包含生物活性多肽混合物。

較優(yōu)的，步驟3)b中，固相萃取柱分離法中，所采用的洗脫液為甲醇和ddh2o的混合液，所述甲醇和ddh2o的混合液中甲醇與ddh2o的體積比為80:20，所述甲醇和ddh2o的混合液中含有0.1％(v/v)的甲酸。

較優(yōu)的，步驟3)b中，固相萃取柱分離法中，采用甲醇活化waterssep-pakc18固相萃取柱；優(yōu)選2ml甲醇。

較優(yōu)的，步驟3)b中，固相萃取柱分離法中，采用ddh2o平衡waterssep-pakc18固相萃取柱；優(yōu)選1mlddh2o。

較優(yōu)的，步驟3)b中，固相萃取柱分離法中，將步驟3)a中收集的濾液進行稀釋50倍后上樣，采用400ul洗脫液洗脫。

較優(yōu)的，步驟3)b固相萃取柱分離法中，先采用2ml甲醇活化waterssep-pakc18固相萃取柱，采用1mlddh2o平衡waterssep-pakc18固相萃取柱；上樣樣品為2ml；將步驟3)a中收集的濾液稀釋50倍，采用400μl洗脫液洗脫。

較優(yōu)的，步驟4)所述兩步酶解法具體步驟為將步驟3)得到的含有多肽的混合物溶于滅菌去離子水中，調(diào)節(jié)ph值為2.0±0.1,再加入胃蛋白酶，獲得反應(yīng)液，于37±0.5℃的恒溫水浴中保溫反應(yīng)90min，獲得第一步酶解液；將第一步酶解液的ph值調(diào)整為7.5±0.1，并加入胰酶，于37±0.5℃的恒溫水浴中保溫反應(yīng)150min，獲得第二步酶解液；將第二步酶解液采用沸水浴法使酶失活，時間為5min，獲得酶解產(chǎn)物；采用冷凍干燥獲得粉狀酶解產(chǎn)物。

更優(yōu)選的，所述沸水浴法為95℃水浴法。

較優(yōu)的，步驟4)所述胃蛋白酶的添加量為胃蛋白酶10～30mg/g底物；所述胰酶的添加量為胰酶30～50mg/g底物。

更優(yōu)的，步驟4)所述胃蛋白酶的添加量為胃蛋白酶20mg/g底物；所述胰酶的添加量為胰酶40mg/g底物。

較優(yōu)的，提取分子量為501.26da的多肽的洗脫峰，即為生物活性多肽ntvpa；提取分子量為544.38da的多肽的洗脫峰，即為生物活性多肽vvtil；提取分子量為614.37da的多肽的洗脫峰，即為生物活性多肽pkknq。

在本發(fā)明中，已知ntvpa的分子量，提取分子大小為501.26da的洗脫峰，即為本發(fā)明的生物活性多肽ntvpa。具體的，本發(fā)明ntvpa分子大小為501.26da的洗脫峰其保留時間為1.93min。

在本發(fā)明中，已知vvtil的分子量，提取分子大小為544.38da的洗脫峰，即為本發(fā)明的生物活性多肽vvtil。具體的，本發(fā)明ntvpa分子大小為544.38da的洗脫峰其保留時間為7.30min。

在本發(fā)明中，已知pkknq的分子量，提取分子大小為614.37da的洗脫峰，即為本發(fā)明的生物活性多肽pkknq。具體的，本發(fā)明pkknq分子大小為614.37da的洗脫峰其保留時間為10.36min。

本發(fā)明第三方面公開了前述生物活性多肽ntvpa、vvtil、pkknq或其衍生物在制備抗氧化和/或增強機體免疫力的食品、保健品及藥物中的應(yīng)用。

本發(fā)明的生物活性多肽ntvpa、vvtil、pkknq、或其衍生物可以用于酸奶等乳制品以及各種食品、減少自由基對皮膚傷害的化妝品；并且由于本發(fā)明的生物活性多肽ntvpa、vvtil、pkknq能夠通過胃腸道直接吸收不被降解，因此可以用于制備提高免疫力的保健品，或者用于制備具有抗氧化和/或增強機體免疫力的藥物。

本發(fā)明第四方面公開了一種抗氧化藥物，包含前述生物活性多肽ntvpa、vvtil、pkknq或前述生物活性多肽的衍生物。

本發(fā)明第五方面公開了一種增強機體免疫力藥物，包含前述生物活性多肽ntvpa、vvtil、pkknq或前述生物活性多肽的衍生物。

本發(fā)明第六方面公開了一種潛在的延緩衰老/抗衰老的保健產(chǎn)品，包含前述生物活性多肽ntvpa、vvtil、pkknq或前述生物活性多肽的衍生物。

所述多肽的衍生物，是指在多肽的氨基酸側(cè)鏈基團上、氨基端或羧基端進行羥基化、羧基化、羰基化、甲基化、乙?；⒘姿峄?、酯化或糖基化等修飾，得到的多肽衍生物。

本發(fā)明生物活性多肽的有益效果為：本發(fā)明的乳源性生物活性多肽ntvpa、vvtil、pkknq具有很好的抗氧化活性和促進機體免疫力活性；一方面能夠清除機體內(nèi)的自由基，減少自由基對人體的傷害；另一方面，本發(fā)明的生物活性多肽還能夠增強機體免疫力，增強巨噬細胞的吞噬功能，提高機體抵御外界病原體感染的能力，降低機體發(fā)病率，而且模擬消化實驗結(jié)果表明發(fā)現(xiàn)的三條生物活性多肽在通常的動物體內(nèi)消化條件下穩(wěn)定，不會被進一步降解，能夠被動物機體直接吸收利用發(fā)揮其具有的生物活性功能，對開發(fā)具有抗氧化功能、增強免疫功能、延緩衰老的食品、保健品和藥品具有十分重要的意義和應(yīng)用價值。

附圖說明

圖1：瑞士乳桿菌發(fā)酵乳消化產(chǎn)物的洗脫圖譜

圖2：質(zhì)量色譜提取圖(m/z＝501.26)

圖3：質(zhì)荷比為501.26的片段的一級質(zhì)譜圖

圖4：質(zhì)量色譜提取圖(m/z＝544.38)

圖5：質(zhì)荷比為544.38的片段的一級質(zhì)譜圖

圖6：質(zhì)量色譜提取圖(m/z＝614.37)

圖7：質(zhì)荷比為614.37的片段的一級質(zhì)譜圖

圖8：質(zhì)荷比為501.26的片段的二級質(zhì)譜圖

圖9：質(zhì)荷比為501.26預(yù)測得到的序列的az，by斷裂情況(ntvpa)

圖10：質(zhì)荷比為544.38的片段的二級質(zhì)譜圖

圖11：質(zhì)荷比為544.38預(yù)測得到的序列的az，by斷裂情況(vvtil)

圖12：質(zhì)荷比為614.37的片段的二級質(zhì)譜圖

圖13：質(zhì)荷比為614.37預(yù)測得到的序列的az，by斷裂情況(pkknq)

圖14：對照組質(zhì)量色譜提取圖(m/z＝544.38)

圖15：對照組質(zhì)荷比為544.38的片段的一級質(zhì)譜圖

圖16：對照組質(zhì)荷比為544.38的片段的二級質(zhì)譜圖

圖17：對照組質(zhì)荷比為544.38預(yù)測得到的序列的az，by斷裂情況(vvtil)

圖18：trolox標準曲線

具體實施方式

在進一步描述本發(fā)明具體實施方式之前，應(yīng)理解，本發(fā)明的保護范圍不局限于下述特定的具體實施方案；還應(yīng)當理解，本發(fā)明實施例中使用的術(shù)語是為了描述特定的具體實施方案，而不是為了限制本發(fā)明的保護范圍。

當實施例給出數(shù)值范圍時，應(yīng)理解，除非本發(fā)明另有說明，每個數(shù)值范圍的兩個端點以及兩個端點之間任何一個數(shù)值均可選用。除非另外定義，本發(fā)明中使用的所有技術(shù)和科學術(shù)語與本技術(shù)領(lǐng)域技術(shù)人員通常理解的意義相同。除實施例中使用的具體方法、設(shè)備、材料外，根據(jù)本技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員對現(xiàn)有技術(shù)的掌握及本發(fā)明的記載，還可以使用與本發(fā)明實施例中所述的方法、設(shè)備、材料相似或等同的現(xiàn)有技術(shù)的任何方法、設(shè)備和材料來實現(xiàn)本發(fā)明。

除非另外說明，本發(fā)明中所公開的實驗方法、檢測方法、制備方法均采用本技術(shù)領(lǐng)域常規(guī)的分子生物學、生物化學、染色質(zhì)結(jié)構(gòu)和分析、分析化學、細胞培養(yǎng)、重組dna技術(shù)及相關(guān)領(lǐng)域的常規(guī)技術(shù)。這些技術(shù)在現(xiàn)有文獻中已有完善說明，具體可參見sambrook等molecularcloning：alaboratorymanual，secondedition，coldspringharborlaboratorypress，1989andthirdedition，2001；ausubel等，currentprotocolsinmolecularbiology，johnwiley&sons，newyork，1987andperiodicupdates；theseriesmethodsinenzymology，academicpress，sandiego；wolffe，chromatinstructureandfunction，thirdedition，academicpress，sandiego，1998；methodsinenzymology，vol.304，chromatin(p.m.wassarmananda.p.wolffe，eds.)，academicpress，sandiego，1999；和methodsinmolecularbiology，vol.119，chromatinprotocols(p.b.becker，ed.)humanapress，totowa，1999等。

實施例1活性肽ntvpa、vvtil、pkknq的制備

一、瑞士乳桿菌發(fā)酵乳的制備

采用脫脂奶粉(新西蘭nzmp牌脫脂奶粉)與水配置12wt％的脫脂乳(12wt％的脫脂乳的制備為將12g脫脂奶粉加入到88g水中，下同)。隨后，將購買的菌種活化即以2％的量接種到12％(w/v)的滅菌脫脂乳中培養(yǎng)，溫度37℃，培養(yǎng)時間7h，即完成瑞士乳桿菌的活化，連續(xù)活化2次，制得發(fā)酵乳，作為瑞士乳桿菌發(fā)酵乳發(fā)酵劑備用。

取10ml已制備的瑞士乳桿菌發(fā)酵劑接種到500ml已滅菌的12wt％脫脂乳中(接種率為2v/v％)，37℃發(fā)酵7小時后，攪開凝乳后，在4℃條件下保存，得到瑞士乳桿菌發(fā)酵乳。

二、生物活性多肽混合物的制得和確認

1.實驗方法

1)樣品處理

分別將前一步驟制備的瑞士乳桿菌發(fā)酵乳和對照發(fā)酵乳，以及12wt％的脫脂乳裝入離心管中進行低溫離心，離心條件為9000rpm/min，4℃，20min。離心后棄沉淀，取上清液。

將上清液分別倒入超濾管中，濾膜的截留分子量為3kda，超濾過程中，轉(zhuǎn)速為4800r/min，時間為30min，離心溫度為4℃。收集瑞士乳桿菌發(fā)酵乳的濾液，于-4℃冷凍保存。

將2ml超濾液稀釋50倍后固相萃取，用1mlc18小柱，2ml甲醇活化柱子，1mlddh2o平衡柱子，上樣樣品為2ml稀釋50倍后的濾液，最后400μl洗脫液洗脫，其中洗脫液為80:20v/v甲醇/水和0.1％v/v的甲酸。

將得到的洗脫液氮吹后凍干成干粉，后模擬胃腸道消化實驗：首先，采用滅菌去離子水溶解干粉，在溶液中加入胃蛋白酶(購自sigma公司)，比例是每克樣品加入胃蛋白酶20mg，調(diào)節(jié)反應(yīng)液的ph值至2.0，在37℃恒溫水浴中保溫90min；然后將反應(yīng)液的ph值調(diào)整至7.5，加入胰酶(corolasepp，購自德國ab公司)，比例是每克樣品加入胰酶40mg，在37℃恒溫水浴中保溫150min；最后置于95℃水浴中加熱5min使酶失活。同時設(shè)置對照組，除不加入胃蛋白酶和胰蛋白酶外，在相同時間做相同的ph和溫度處理。將對照組和樣品組真空冷凍干燥成粉末后，存儲于-80℃?zhèn)溆谩?/p>

2)液質(zhì)分析

液相色譜條件：

儀器：watersacquityuplc超高效液相色譜儀

色譜柱規(guī)格：cshc18色譜柱

流速：0.4ml/min

溫度：45℃

紫外檢測波長：220nm

進樣量：5μl

流動相a液：ddh2o

流動相b液：乙腈溶液

梯度條件：0min-2.5min保持99％a液，1％b液；2.5min-5minb液從1％變?yōu)?％，a液從99％變?yōu)?5％；5min-10minb液從5％變?yōu)?0％，a液從95％變?yōu)?0％；10min-17min％b液從10％變?yōu)?5％，a液從90％變?yōu)?5％；17min-22min，b液從25％變?yōu)?0％，a液從75％變?yōu)?0％；22min-27min，b液從40％變?yōu)?0％，a液從60％變?yōu)?0％；27min-29min，b液從80％變?yōu)?00％，a液為0％，保持2min；31min-31.5min，b液從100％變?yōu)?％，a液從0％變?yōu)?5％；31.5min-32min，b液從5％變?yōu)?％，a液從95％變?yōu)?9％；32min-34min，保持99％a液，1％b液。

質(zhì)譜條件：

離子方式：es+

質(zhì)量范圍(m/z)：50-2000

毛細管電壓(capillary)(kv)：3.0

采樣錐(v)：35.0

離子源溫度(℃))：105

去溶劑溫度(℃)：350

錐孔氣流量(l/hr)：50.0

去溶劑氣流(l/hr)：600.0

碰撞能量(ev)：6.0

碰撞氣流(ml/min)：0.6

掃描時間(sec)：0.26

內(nèi)掃描時間(sec)：0.02

根據(jù)上述實驗條件，利用masslynx軟件分析，得到瑞士乳桿菌發(fā)酵乳消化產(chǎn)物中多肽物質(zhì)保留時間和分子量，如表1所示，用masslynx軟件提取多肽的質(zhì)量色譜提取圖、一級質(zhì)譜圖，見圖2-7。

表1瑞士乳桿菌發(fā)酵乳消化產(chǎn)物中的多肽核質(zhì)比

三、生物活性多肽的氨基酸序列確定方法

1.實驗方法

(1)牛乳來源κ-酪蛋白氨基酸序列庫的建立

κ-酪蛋白氨基酸序列通過biopep搜索得到，將搜索得到的酪蛋白氨基酸序列建成一個數(shù)據(jù)庫。

2)多肽質(zhì)量的匹對

對uplc-ms分析得到的質(zhì)量，在牛奶蛋白的氨基酸序列數(shù)據(jù)庫中進行搜索，得到相關(guān)的多肽序列。該步驟通過java程序和mysql數(shù)據(jù)庫實現(xiàn)，具體的要求如下：輸入由uplc-ms得到的質(zhì)量，輸出質(zhì)量誤差在±0.01內(nèi)的多肽序列、該序列的質(zhì)量、該序列的具體蛋白來源。

3)多肽序列的驗證

將得到的氨基酸序列通過masslynx軟件中的biolynx驗證，將預(yù)測得到多肽序列理論上的二級質(zhì)譜圖與ms/ms得到的實際二級質(zhì)譜圖對比，軟件通過二級質(zhì)譜圖中主要的峰是否匹對成功，給出分值，來確認預(yù)測得到的多肽。二級質(zhì)譜匹對圖和預(yù)測得到的序列的az，by斷裂情況圖見圖8-13所示。

2.實驗結(jié)果

經(jīng)過驗證得到生物活性多肽ntvpa、vvtil、pkknq，均為乳源性，具體來源于牛乳κ-酪蛋白，其中ntvpa為κ-酪蛋白第102～106位的氨基酸殘基，vvtil為κ-酪蛋白第8～12位的氨基酸殘基，pkknq為κ-酪蛋白第131～135位的氨基酸殘基，分別記為seqidno：1-3。

此外，通過對照組的實驗結(jié)果可知多肽ntvpa、pkknq均未在對照組的相同保留時間處出峰，即ntvpa、pkknq兩種都是經(jīng)胃腸道模擬消化降解得到，并不存在于瑞士乳桿菌發(fā)酵乳中。而多肽vvtil在對照組的相同保留時間處出峰，如圖14～17所示，并且峰面積的改變不大，說明多肽vvtil是由瑞士乳桿菌分解牛乳中κ-酪蛋白得到的生物活性多肽，而且在消化酶的作用下相對穩(wěn)定，經(jīng)胃腸道模擬消化試驗后不易被降解。

實施例2生物活性肽的抗氧化活性實驗

采用清除自由基法(dpph·法)和總抗氧化能力法(abts法)，對實施例1得到的生物活性多肽的抗氧化活性進行了測試。

1、[dpph·]法測定生物活性肽的體外抗氧化活性

1)實驗試劑及儀器

試劑：1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl[dpph·])，日本wako公司生產(chǎn)；甲醇，上海國藥公司提供；合成實施例1中得到的乳源性生物活性多肽。

主要儀器：pro200酶標儀，奧地利tecan公司產(chǎn)品；96孔細胞培養(yǎng)板，美國millipore公司制造；分析天平，meitelei-tolido公司產(chǎn)品。

2)實驗方法

(1)0.1mmol/l[dpph·]甲醇溶液

用分析天平稱取19.72mg[dpph·]溶于500ml甲醇溶液中，配制得到的0.1mmol/l[dpph·]甲醇溶液，錫紙避光保存，即配即用。

(2)[dpph·]法測定生物活性肽的抗氧化活性

在1.5mlep管中加入500μl濃度為0.1mmol/l[dpph·]甲醇溶液、按表2分別加入500μl不同濃度的待測樣品和去離子水作為空白對照。

待檢測樣品加樣完畢后，混合均勻，室溫靜置30min后取200微升至96孔板中，用酶標儀在517nm處檢測吸光值。按照下式計算自由基清除率，實驗結(jié)果見表1。

公式：[dpph·]自由基清除率＝(a0-as)/a0×100％

其中a0表示空白對照組的吸光值，as表示樣品組的吸光值。

表2dpph法測定生物活性多肽的總抗氧化能力結(jié)果

通過[dpph·]法對生物活性多肽ntvpa、vvtil、pkknq體外總抗氧化活性進行了測定，發(fā)現(xiàn)多肽ntvpa具有清除自由基能力，其具體ic50(mg/ml)值見表2。根據(jù)抗氧化能力的標準可認定發(fā)明的生物活性多肽具有抗氧化能力。

2、abts法測定生物活性肽的體外抗氧化活性

1)實驗試劑及儀器

試劑：總抗氧化力試劑盒(abts法)，碧云天公司生產(chǎn)；甲醇，上海國藥公司提供；合成實施例1中得到的乳源性生物活性多肽。

主要儀器：pro200酶標儀，奧地利tecan公司產(chǎn)品；96孔細胞培養(yǎng)板，美國millipore公司制造。

2)實驗方法

(1)abts工作液的配置

取40微升abts溶液與40微升氧化劑溶液配制成abts工作母液，配制后避光存放12-16小時后使用，配好的abts工作母液在室溫下避光存放，2-3天內(nèi)穩(wěn)定。使用前，把abts工作母液用pbs稀釋成abts工作液，大約40倍，要求abts工作液的吸光度減去相應(yīng)的pbs空白對照后，a734為0.7±0.05。

(2)trolox標準曲線的制作

用樣品配制溶液稀釋標準品，把10mmtrolox標準溶液稀釋成0.005、0.01、0.03、0.05、0.1、0.25、0.5和1.0mm。在96孔板的每個檢測孔中加入200微升abts工作液，標準曲線檢測孔內(nèi)加入10微升各種濃度的trolox標準溶液，輕輕混勻。室溫孵育4分鐘后，用酶標儀在734nm處測定吸光值。

trolox濃度與吸光值呈良好的正比關(guān)系，濃度越高，吸光值越低。本發(fā)明trolox標準曲線結(jié)果見圖14，標準曲線的線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)為0.9981，trolox標準曲線的精密度和準確度均符合檢測要求，可用于后續(xù)計算。

(3)abts法測定生物活性肽的抗氧化活性

在96孔板的每個檢測孔中加入200微升abts工作液，空白對照孔中加入10微升pbs溶液，樣品檢測孔內(nèi)加入10微升各種樣品，輕輕混勻。室溫孵育4分鐘后，用酶標儀在734nm處測定吸光值。測定根據(jù)標準曲線計算出樣品的總抗氧化能力?？偪寡趸芰Ρ硎痉绞揭詔rolox標準溶液的濃度來表示。按照下式計算總抗氧化能力，實驗結(jié)果見表3：

表3abts法測定生物活性多肽的總抗氧化能力結(jié)果

通過總抗氧化能力法(abts法)對生物活性多肽ntvpa、vvtil、pkknq體外總抗氧化活性進行了測定，發(fā)現(xiàn)生物活性多肽ntvpa具有較強的抗氧化能力：在濃度為5mg/ml情況下多肽ntvpa所對應(yīng)的trolox濃度為1.0554mmol/l。因此，可認定發(fā)明的生物活性多肽ntvpa具有顯著的抗氧化能力，而vvtil、pkknq具有一定的抗氧化能力，但相對ntvpa較弱。

根據(jù)以上實驗結(jié)果說明來源于κ-酪蛋白的生物活性多肽ntvpa、vvtil、pkknq具有抗氧化能力，能夠清除動物機體內(nèi)的自由基，具有潛在的延緩衰老/抗衰老功能。

以上所述，僅為本發(fā)明的較佳實施例，上述實施例僅例示性說明本發(fā)明的原理及其功效，而并非對本發(fā)明任何形式上和實質(zhì)上的限制，應(yīng)當指出，對于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員，在不脫離本發(fā)明方法的前提下，還將可以做出若干改進和補充，這些改進和補充也應(yīng)視為本發(fā)明的保護范圍。凡熟悉本專業(yè)的技術(shù)人員，在不脫離本發(fā)明的精神和范圍的情況下，當可利用以上所揭示的技術(shù)內(nèi)容而做出的些許更動、修飾與演變的等同變化，均為本發(fā)明的等效實施例；同時，凡依據(jù)本發(fā)明的實質(zhì)技術(shù)對上述實施例所作的任何等同變化的更動、修飾與演變，均仍屬于本發(fā)明的技術(shù)方案的范圍內(nèi)。

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<110>浙江輝肽生命健康科技有限公司

<120>κ-酪蛋白來源生物活性肽的制備和應(yīng)用

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