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一種降解苯酚的鹽單胞菌的制作方法

文檔序號:11246195閱讀:1354來源:國知局
一種降解苯酚的鹽單胞菌的制造方法與工藝

本發(fā)明涉及微生物及生物降解技術領域,具體地,涉及一種鹽單胞菌及其在降解苯酚中的應用。



背景技術:

苯酚及其衍生物對人和動植物的毒性很強,已被列入環(huán)境優(yōu)先控制污染物名單。含酚廢水主要來源于造紙、煉油、合成纖維、合成橡膠、農藥等行業(yè),是工業(yè)排放廢水中主要的污染物。在這些含酚廢水中除了含苯酚類污染物之外,往往還含有大量鹽分而使之成為高鹽含酚廢水,這類廢水排放到環(huán)境中會對土壤、地表水和地下水造成嚴重污染。由于高鹽環(huán)境對微生物生長具有抑制和毒害作用,使得常規(guī)的生物降解技術在處理這類廢水時存在瓶頸問題。嗜鹽菌能直接用于去除高鹽工業(yè)廢水中的有機污染物而無需先降低廢水鹽度,因而逐漸受到人們的廣泛關注。

鹽單胞菌(halomonastaeanensis)革蘭氏陽性桿狀,成單或雙。有鞭毛,位置因菌種而異,周身或極端。有動力。在含鹽8%的培養(yǎng)基上,菌落白色或奶酪色,光滑,直徑小于2mm。兼性厭氧菌。還原硝酸鹽為亞硝酸鹽。觸媒陽性。kovas氏氧化酶通常陽性,細胞色素氧化酶陰性。發(fā)酵葡萄糖產酸??稍诤}量達8%的培養(yǎng)基中生長,耐鹽范圍0-32%。適合ph5-9生長。生長溫度:15-45c。目前有對鹽單胞菌在正常條件下對污染物降解特性的研究,但是在高鹽條件下對污染物降解的研究,尤其是對酚類物質的降解特性未見相關報道。



技術實現(xiàn)要素:

本發(fā)明的目的在于提供一株能夠降解苯酚的鹽單胞菌。

本發(fā)明從鹽湖淤泥中分離到一株能夠降解苯酚的菌株。通過菌株形態(tài)學特征,生理生化特征和16srrna序列分析將該菌株鑒定為鹽單胞菌,命名為h17,該菌株于2016年6月2日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心(簡稱,地址:中國武漢武漢大學,郵編430072),保藏編號為cctccno.m2016306,分類名為鹽單胞菌halomonastaeanensis。

本發(fā)明提供了含有鹽單胞菌h17的菌劑。

本發(fā)明提供了含有鹽單胞菌h17的生物清潔劑。

本發(fā)明提供了鹽單胞菌h17或含有其的菌劑或含有其的生物清潔劑在清潔環(huán)境中的應用。

進一步,本發(fā)明提供了鹽單胞菌h17或含有其的菌劑或含有其的生物清潔劑在降解苯酚中的應用。

本發(fā)明提供了鹽單胞菌h17或含有其的菌劑或含有其的生物清潔劑在處理工業(yè)廢水中的應用。

本發(fā)明提供了鹽單胞菌h17或含有其的菌劑或含有其的生物清潔劑在處理醫(yī)用廢水中的應用。

本發(fā)明提供了鹽單胞菌h17在制備生物清潔劑中的應用。

本發(fā)明提供了鹽單胞菌h17在制備生物降解劑中的應用。

所述生物降解劑為苯酚降解劑。

本發(fā)明的鹽單胞菌h17能夠在50h內,濃度5%-10%的環(huán)境下,可降解濃度為200mg/l苯酚達到90%以上,當氯化鈉濃度達到15%時,對苯酚的降解率也可達到80%以上,表明該菌具有很好的抗鹽效果。本發(fā)明提供的鹽單胞菌h17及其菌劑在使用過程中無污染,無公害,能夠應用于苯酚污染環(huán)境的生物修復或高鹽環(huán)境下的苯酚的降解,可廣泛應用于環(huán)境清潔領域,含苯酚的工業(yè)廢水或醫(yī)用廢水處理領域,具有較好的經濟價值和應用前景。

附圖說明

圖1為菌株h17與相近種16srdna序列進化樹,通過菌株h17的16srrna序列比對分析,與其最相近的是泰安郡鹽單胞菌(halomonastaeanensisbh539),相似性為99%。

圖2為菌株h17的生長及對苯酚降解的特性圖。

圖3為菌株h17在不同鹽濃度下對苯酚的降解圖。

圖4為苯酚濃度的標準曲線(od270)。

圖5為菌株h17在不同初始苯酚濃度中的生長及降解苯酚特性圖。

具體實施方式

以下實施例用于說明本發(fā)明,但不用來限制本發(fā)明的范圍。在不背離本發(fā)明精神和實質的情況下,對本發(fā)明方法、步驟或條件所作的修改或替換,均屬于本發(fā)明的范圍。

若未特別指明,實施例中所用的化學試劑均為常規(guī)市售試劑,實施例中所用的技術手段為本領域技術人員所熟知的常規(guī)手段。

實施例1鹽單胞菌h17的分離和鑒定

1、鹽單胞菌h17的分離

a、將采集到的固體樣品(鹽湖淤泥、海底淤泥、高鹽廢水處理污泥等)1-5g或500ml的液體樣品(鹽湖水、海水、高鹽廢水等)過濾物,溶于10-50ml液體培養(yǎng)基(10gmgso4·7h2o、0.2gcacl2·2h2o、2-5gkcl、2.5g胰蛋白胨、10g酵母提取物、nacl15%、蒸餾水添加至1000ml。調節(jié)ph為7.2左右,121℃滅菌15min),室溫下,轉速80-160rpm振蕩30-120分鐘,取出靜置20-40分鐘,用移液器吸取100μl,均勻涂布在固體培養(yǎng)基的培養(yǎng)平板上(上述液體培養(yǎng)基加2%瓊脂得),置于28℃恒溫培養(yǎng)箱中進行靜置培養(yǎng)。

b、直到培長出可見菌落時,用接種環(huán)挑取單個菌落,在平板固體培養(yǎng)基表面上連續(xù)劃線;

c、如此反復劃線培養(yǎng),直至獲得純培養(yǎng)嗜鹽菌菌株。

d、挑取純培養(yǎng)的單個菌落,轉接于含有苯酚的液體培養(yǎng)基中,在28℃、150rpm的恒溫搖床中進行培養(yǎng),菌液至渾濁;

本步驟中的液體培養(yǎng)基1l配方為nacl100g、tris2g、kcl2g、kno31g、nh4cl5g、mgso4·7h2o24g、mnso4·h2o0.688g、cacl20.12g、葡萄糖1g,蒸餾水添加至1000ml。100ml上述液體培養(yǎng)基中加入滅過菌的0.05mol/lna2hpo42ml、0.01mol/lfeso42ml、10mg/ml酵母提取物2ml、10mg/ml胰蛋白胨2ml、10mg/ml苯酚2ml(換算后為200mg/l苯酚溶液)。

e、用移液器吸取200μl菌液轉接于步驟d所述的含有苯酚的液體培養(yǎng)基中,如此反復5-8次,獲得一株穩(wěn)定高效的降解苯酚的嗜鹽菌,命名為h17。

2、菌株的形態(tài)學特征

該菌菌落呈乳白色,圓形,隆起,表面濕潤,比較光滑,菌落邊緣很整齊,革蘭氏染色后呈紅色,為革蘭氏陰性桿菌。

3、16srdna鑒定

該菌株的16srdna部分序列長為1285bp,將該序列在ncbi網(wǎng)站(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)上進行blast比對分析,通過在genbank中進行blastn序列比對,挑選與菌株h17同源序列相似性最高的有代表性的菌株,采用鄰位相接法(neighbor-joining)利用mega6.0軟件構建系統(tǒng)進化樹,見圖1,自展檢驗(bootstrap)1000次。顯示菌株h17為鹽單胞菌,與目前已發(fā)表的鹽單胞菌序列相似性達99%。

綜合菌體形態(tài)、生理生化特性和16srdna基因序列,該菌株h17于2016年6月2日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心(簡稱,地址:中國武漢武漢大學,郵編430072),保藏編號為cctccno.m2016306,分類名為鹽單胞菌halomonastaeanensis。

實施例2鹽單胞菌h17的降解苯酚性能試驗

采用高效液相色譜法檢測鹽單胞菌h17對培養(yǎng)基中苯酚降解作用。

1、菌株h17的生長及對苯酚降解的特性

菌株h17在苯酚濃度為200mg/l,氯化鈉濃度為10%的培養(yǎng)基,所述培養(yǎng)基1l的配方為10gmgso4·7h2o、0.2gcacl2·2h2o、2-5gkcl、2.5g胰蛋白胨、10g酵母提取物、nacl10%、蒸餾水添加至1000ml。調節(jié)ph為7.2左右,121℃滅菌15min。

中隨時間變化菌株的生長與苯酚濃度變化曲線如圖2所示。菌株h17在經過8h左右的停滯期后進入對數(shù)生長期,在此期間,菌株隨時間幾乎進行線性生長,接近30h及以后菌株處于穩(wěn)定生長期。菌株對苯酚的降解主要在對數(shù)穩(wěn)定期,菌株在此期間增殖能力強,對碳源需求大,苯酚降解速度快。此后,培養(yǎng)基中的碳源苯酚已相對較少,沒有新的碳源補充,代謝產物也不斷積累,菌株生長受到抑制,數(shù)量不再增加,此時菌株對苯酚降解達到最大,苯酚降解率為90%。

2、菌株h17在不同鹽濃度下對苯酚的降解

一般微生物在處理高鹽含苯酚廢水時,由于廢水中鹽濃度會隨著季節(jié)及水流量而變化,使其在處理上遇到瓶頸,這又考驗微生物對變化的鹽環(huán)境的適應性,增大了此類廢水的處理難度。因此,鹽濃度成為微生物降解苯酚的關鍵因素。

見圖3,隨著nacl濃度的增大,菌株的生長和對苯酚的降解是先升高后降低的趨勢。當nacl濃度為10%時,菌株h17的對苯酚的降解達到最大,為90%;當nacl濃度大于15%時,菌株h17對苯酚的降解也可達到85%左右。

3、菌株在不同苯酚濃度下的降解特性研究

試驗方法:將菌株分別接種到苯酚濃度為0mg/l,100mg/l,200mg/l,400mg/l,600mg/l,800mg/l的液體的培養(yǎng)基中(配方為10gmgso4·7h2o、0.2gcacl2·2h2o、2-5gkcl、2.5g胰蛋白胨、10g酵母提取物、nacl10%、蒸餾水添加至1000ml)。調節(jié)ph保持在7.0,以165r/min的轉速在溫度為30℃的恒溫搖床中進行培養(yǎng),其他條件不變。測初始生物量和苯酚濃度以及在恒溫搖床上培養(yǎng)72h后的生物量和苯酚濃度。

測定方法:吸取培養(yǎng)0h和60h后的培養(yǎng)液1ml,加入到5ml的離心管中,再向離心管中加入3ml的無菌培養(yǎng)液,稀釋混勻后,使用紫外可見分光光度計檢測其生物量od600。同時,吸取培養(yǎng)0h和60h后的培養(yǎng)液1ml,加入到1.5ml的離心管中,將其在6000r/min條件下離心10min,取上清液0.8ml加入到5ml的離心管中,再向離心管加入2.4ml無菌培養(yǎng)液,混勻后將紫外可見分光光度計波長設定為270nm,進行苯酚吸光度的測定,根據(jù)苯酚標準曲線(圖4)計算苯酚初始濃度和60h濃度,從而計算苯酚降解率。

結果分析:通過數(shù)據(jù)分析可知,苯酚濃度的變化對菌株h17的生長和降解苯酚的能力有顯著性影響(p<0.01)。由圖5可知,菌株的生長和對苯酚的降解隨苯酚濃度的變化有相似的規(guī)律,均隨苯酚濃度的增大有先升高后降低的趨勢。當苯酚濃度為200mg/l時,菌株h17的生長及對苯酚的降解均達到最大,其生物量od600為1.8,苯酚降解率為90%以上。通過多重比較可知,當苯酚濃度大于或小于200mg/l,菌株h17的生長和對苯酚的降解均顯著變化(p<0.01)。

雖然,上文中已經用一般性說明及具體實施方案對本發(fā)明作了詳盡的描述,但在本發(fā)明基礎上,可以對之作一些修改或改進,這對本領域技術人員而言是顯而易見的。因此,在不偏離本發(fā)明精神的基礎上所做的這些修改或改進,均屬于本發(fā)明要求保護的范圍。

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