EGFR-TKI耐藥的人肺腺癌HCC827細(xì)胞株、試劑盒及其應(yīng)用的制作方法

本發(fā)明涉及一種egfr-tki耐藥的細(xì)胞株、試劑盒及其應(yīng)用，尤其涉及一種egfr-tki耐藥的人肺腺癌hcc827細(xì)胞株、試劑盒及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、肺癌主要分為非小細(xì)胞肺癌(non-small?cell?lung?carcinoma，nsclc)和小細(xì)胞肺癌(small?cell?lung?carcinoma，sclc)。其中，肺腺癌是非小細(xì)胞肺癌中最常見(jiàn)的亞型，幾乎占總肺癌發(fā)生的50％，總體生存率較低。2015版who肺腫瘤組織學(xué)以腫瘤的生長(zhǎng)方式為基礎(chǔ)，將肺腺癌重新分類(lèi)：①浸潤(rùn)前病變，包括原位腺癌和非典型腺瘤樣增生；②早期浸潤(rùn)病變，被命名為微小浸潤(rùn)腺癌；③浸潤(rùn)性腺癌，包括伏壁型、腺泡型、乳頭型、微乳頭型、實(shí)性型，并引入了浸潤(rùn)性黏液腺癌、膠樣型、胎兒型、腸型腺癌。肺腺癌的診斷是一個(gè)多學(xué)科的過(guò)程，需要綜合臨床、放射學(xué)、分子生物學(xué)和病理學(xué)各項(xiàng)信息，以便于準(zhǔn)確判斷預(yù)后及尋找治療靶點(diǎn)。其中，分子生物學(xué)檢測(cè)對(duì)提高肺腺癌早期診斷率及改善患者預(yù)后具有重要意義，為尋找肺腺癌的新型診斷方法提供了更多可能。

2、傳統(tǒng)的肺腺癌治療方法通常為化療藥物鉑類(lèi)化合物，或者是物理療法，但其患者整體存活率變化不大。直到近十幾年隨著表皮生長(zhǎng)因子受體酪氨酸激酶抑制劑(egfr-tyrosine?kinases?inhibitor，egfr-tki)和腫瘤免疫療法的發(fā)展，才使得非小細(xì)胞癌癥包括肺腺癌在內(nèi)的肺癌治療取得長(zhǎng)足的進(jìn)步。一般nsclc患者發(fā)生表皮生長(zhǎng)因子受體(egfr)異常會(huì)導(dǎo)致受體酪氨酸激酶(receptor?tyrosine?kinase，rtk)信號(hào)的異常激活，egfr-tki可阻斷激活胞內(nèi)區(qū)酪氨酸激酶，避免引發(fā)下游級(jí)聯(lián)反應(yīng)引起的癌細(xì)胞增殖。目前，egfr-tki已成為治療攜帶egfr異常突變的nsclc的一線藥物。然而，無(wú)論是分子靶向療法還是肺癌免疫療法，均不可避免出現(xiàn)腫瘤耐藥。因此，研究肺癌耐藥機(jī)制，尋找克服策略，或者發(fā)展新的免疫治療手段均具有重要的臨床意義。

3、第一代egfr-tki[如吉非替尼(gefitinib)和厄洛替尼(erlotinib)]是標(biāo)志著nsclc靶向治療史上的重大事件。它預(yù)示著腫瘤靶向精準(zhǔn)治療的問(wèn)世，并被證明是對(duì)具有egfr敏感突變的nsclc患者有效的一種可逆抑制劑，可以有效延長(zhǎng)患者的生存期。然而遺憾的是，大多數(shù)患者在治療9-13個(gè)月后產(chǎn)生了耐藥性。egfr基因突變與該耐藥性的產(chǎn)生密切相關(guān)。在這些基因突變中，egfr的第19號(hào)和第20號(hào)外顯子突變占總突變的90％，第20號(hào)外顯子t790m突變是第一代egfr-tki出現(xiàn)耐藥的主要原因。針對(duì)這一特點(diǎn)，第二代egfr-tki[如阿法替尼(afatinib)]問(wèn)世，其在苯胺喹唑啉的基礎(chǔ)之上，引入了邁克爾加成受體丙烯酰胺。第二代egfr-tki是egfr和her2的不可逆抑制劑，其通過(guò)共價(jià)結(jié)合egfr基因的c797殘基克服第一代egfr-tki引起的單突變帶來(lái)的問(wèn)題。但是高劑量的藥物使患者產(chǎn)生難以接受的毒副作用，而且也不可避免的產(chǎn)生新的耐藥突變，對(duì)“l(fā)858r”合并“t790m”、“exon19?del”合并“t790m”的新型雙突變組合的效果不佳。奧希替尼(osimertinib)是第三代egfr-tki，對(duì)第一代egfr-tki誘導(dǎo)的egfr?t790m耐藥突變的非小細(xì)胞肺癌患者療效較好，對(duì)雙突變egfr表現(xiàn)出優(yōu)良的選擇性。但是應(yīng)用osimertinib治療平均9～14個(gè)月后，對(duì)第1代和第2代egfr-tki耐藥突變的nsclc患者可能獲得新的egfr突變(c797s突變)，這種突變出現(xiàn)的可能性較未使用osimertinib治療的患者顯著增加。針對(duì)這一突變，研究者們又研究開(kāi)發(fā)了第四代egfr-tki。針對(duì)不斷的耐藥突變問(wèn)題，研究者們又開(kāi)發(fā)了多種聯(lián)合用藥途徑以及通過(guò)抑制靶向腫瘤微環(huán)境中的免疫抑制因子來(lái)達(dá)到更好的腫瘤抑制效果，但其帶來(lái)的不良反應(yīng)似乎也不可避免。

4、幾項(xiàng)大規(guī)模的3期臨床試驗(yàn)一致證明，第一代egfr-tki(gefitinib和erlotinib)、第二代egfr-tki(afatinib)和第三代egfr-tki(osimertinib)對(duì)egfr激活突變的晚期非小細(xì)胞肺癌患者的療效優(yōu)于標(biāo)準(zhǔn)的一線鉑類(lèi)化療。然而，盡管對(duì)患者此類(lèi)治療有非常高的客觀反應(yīng)率(60-70％)，但獲得性耐藥仍然存在，平均無(wú)進(jìn)展生存期在9-15個(gè)月。研究臨床上出現(xiàn)的egfr-tki耐藥機(jī)制有利于發(fā)現(xiàn)新的生物標(biāo)記物和藥物靶點(diǎn)，推進(jìn)更佳治療方案的發(fā)展。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、為了研究egfr-tki的耐藥問(wèn)題，建立對(duì)egfr-tki耐藥的細(xì)胞株尤為重要。本發(fā)明提供了一種egfr-tki耐藥的人肺腺癌hcc827細(xì)胞株，其是保藏編號(hào)為cctcc?no：c2024221的人肺癌細(xì)胞，命名是osi-r-hcc827-pa。

2、此外，本發(fā)明還提供如上所述的egfr-tki耐藥的人肺腺癌hcc827細(xì)胞株在評(píng)價(jià)治療非小細(xì)胞肺癌耐藥的藥物中的應(yīng)用。

3、在一些實(shí)施方案中，所述非小細(xì)胞肺癌耐藥為肺腺癌耐藥。

4、本發(fā)明還提供如上所述的egfr-tki耐藥的人肺腺癌hcc827細(xì)胞株在篩選治療非小細(xì)胞肺癌耐藥的藥物中的應(yīng)用。

5、在一些實(shí)施方案中，所述非小細(xì)胞肺癌耐藥為肺腺癌耐藥。

6、本發(fā)明還提供一種試劑盒，包含如上所述的egfr-tki耐藥的人肺腺癌hcc827細(xì)胞株。

7、本發(fā)明還提供如上所述的試劑盒在評(píng)價(jià)治療非小細(xì)胞肺癌耐藥的藥物中的應(yīng)用。

8、在一些實(shí)施方案中，所述非小細(xì)胞肺癌耐藥為肺腺癌耐藥。

9、本發(fā)明還提供如上所述的試劑盒在篩選治療非小細(xì)胞肺癌耐藥的藥物中的應(yīng)用。

10、在一些實(shí)施方案中，所述非小細(xì)胞肺癌耐藥為肺腺癌耐藥。

11、與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果體現(xiàn)在：osi-r-hcc827-pa細(xì)胞株對(duì)三代egfr-tki——afatinib、erlotinib、gefitinib、osimertinib均表現(xiàn)出良好的體外耐藥性，其體外耐藥指數(shù)(resistant?index，ri)分別是11018.73、33223.19、5867.67、1610.02。ri的計(jì)算公式為：ri＝relative?ic50篩選獲得細(xì)胞株/relative?ic50親本。relative?ic50親本表示用于篩選的親本細(xì)胞株的相對(duì)半最大效應(yīng)濃度；relative?ic50篩選獲得細(xì)胞株表示篩選得到的細(xì)胞株的半最大效應(yīng)濃度。比如，當(dāng)求osi-r-hcc827-pa對(duì)osimertinib的體外耐藥指數(shù)時(shí)，relativeic50親本帶入通過(guò)試驗(yàn)(見(jiàn)實(shí)施例2)得到的0.00204μmol/l，relative?ic50ebc-1-篩選帶入通過(guò)試驗(yàn)(見(jiàn)實(shí)施例2)得到的3.278μmol/l，從而得到其對(duì)osimertinib的ri為1610.02。

12、osi-r-hcc827-pa細(xì)胞株可作為耐藥腫瘤細(xì)胞模型，有利于更好的研究egfr-tki的耐藥問(wèn)題、研究耐藥肺腺癌細(xì)胞株形態(tài)學(xué)及生物學(xué)特點(diǎn)、揭示肺腺癌的耐藥機(jī)制、篩選能夠逆轉(zhuǎn)肺腺癌耐藥的藥物、開(kāi)發(fā)更有效的肺腺癌治療方法等。osi-r-hcc827-pa及其試劑盒在篩選治療非小細(xì)胞肺癌耐藥的藥物，以及在評(píng)價(jià)治療非小細(xì)胞肺癌耐藥的藥物中都有較高的應(yīng)用價(jià)值。

13、以下將結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明的構(gòu)思、具體結(jié)構(gòu)及產(chǎn)生的技術(shù)效果作進(jìn)一步說(shuō)明，以充分地了解本發(fā)明的目的、特征和效果。