一種液體植酸酶的制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及植酸酶的制備方法，具體涉及一種液體植酸酶的制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 液體酶制劑是一種使用方便，綠色環(huán)保，生物降解性良好的原料。專一的催化特性 及溫和的反應(yīng)條件，在工業(yè)界得到越來(lái)越多的使用和重視。在使用方面液體酶制劑具有以 下優(yōu)點(diǎn)：1)液體酶制劑以分子或微粒狀態(tài)分散在底物中，分散度大，吸收快，能較迅速地發(fā) 生酶解反應(yīng)，酶活性高；2)易于分劑量，容易復(fù)配和二次加工，使用方便；3)有利于提高酶 制劑的利用率，4)直接使用，無(wú)須溶解和活化；5)純度高、雜質(zhì)含量低；6)生產(chǎn)過(guò)程短、成本 低；7)生產(chǎn)加工和使用過(guò)程中不會(huì)造成粉塵污染，有利于保護(hù)環(huán)境；但是，液體酶制劑體積 較大，攜帶、運(yùn)輸、貯存都不方便，酶活性容易受到高溫、冷凍、光照、酸堿性、氧化、濕度等貯 存環(huán)境的影響而顯著降低，并且因?yàn)橐后w酶制劑的水分活度較高，很容易受到微生物的污 染而失活。因此，液體酶制劑的應(yīng)用受到限制，最主要的原因就是其穩(wěn)定性較差，包括生物 穩(wěn)定性和物理、化學(xué)穩(wěn)定性。
[0003] 植酸酶產(chǎn)品在動(dòng)物和人類營(yíng)養(yǎng)方面有非常廣泛的應(yīng)用，植酸酶可分解植酸（即 肌醇六磷酸），植酸是植物體內(nèi)磷酸鹽和肌醇的重要儲(chǔ)存形式。植酸酶是一種新型的食品 添加劑，能降低食物中的植酸而提高磷、鋅、鈣和鐵等的利用率，改善人體對(duì)礦物質(zhì)的吸 收。磷是維持動(dòng)物生長(zhǎng)發(fā)育等生命活動(dòng)必需的重要礦物質(zhì)，同時(shí)也是飼料中最昂貴的組分 之一，植酸酶可催化植酸鹽水解，使植酸鹽中的磷以磷酸根的形式分離出來(lái)從而被動(dòng)物吸 收，提高磷的利用率，降低環(huán)境污染。在國(guó)外，植酸酶已開始試用在植物性食品的深加工 領(lǐng)域，通過(guò)在這些植物性食品中加入適量的植酸酶來(lái)達(dá)到分解植酸磷，減少微量元素的螯 合作用，以平衡營(yíng)養(yǎng)。而我國(guó)食用型的植酸酶的研宄和植酸酶產(chǎn)品的深度開發(fā)還是空白。
[0004] 目前對(duì)植酸酶的研宄主要集中在菌種篩選、基因構(gòu)建菌種和酶學(xué)特性上，其應(yīng)用 領(lǐng)域主要為飼料加工領(lǐng)域，并且主要研宄的是植酸酶在飼料加工中的熱穩(wěn)定性問(wèn)題，以提 高植酸酶添加至飼料中的活性。也有在飼料制粒過(guò)程中后噴涂液體植酸酶的情況，但因飼 料中植酸酶添加量較少，噴涂不均勻，應(yīng)用的很少。食用型植酸酶價(jià)格昂貴，生產(chǎn)技術(shù)不夠 成熟，需進(jìn)一步研宄。隨著植酸酶生產(chǎn)技術(shù)的改進(jìn)，人們生活水平的提高，膳食結(jié)構(gòu)的 合理化，植酸酶作為一種新型的食品添加劑必將有很好的應(yīng)用前景。我國(guó)是養(yǎng)殖和飼料大 國(guó)，存在著飼料資源不足及磷污染環(huán)境嚴(yán)重的問(wèn)題，植酸酶有助于解決這些問(wèn)題。隨著植 酸酶研宄的不斷深入，高活性的植酸酶的表達(dá)，生產(chǎn)成本的下降，及人們對(duì)環(huán)保意識(shí)的進(jìn) 一步增強(qiáng)，國(guó)家法規(guī)執(zhí)行力度的加強(qiáng)，植酸酶產(chǎn)品在畜禽養(yǎng)殖中的應(yīng)用必將越來(lái)越廣泛。 同時(shí)，也要加強(qiáng)液體植酸酶穩(wěn)定性研宄，以適用其應(yīng)用領(lǐng)域的發(fā)展。
[0005] 因此，面對(duì)植酸酶廣闊的發(fā)展前景，制備一種穩(wěn)定性強(qiáng)的液體植酸酶以拓展其應(yīng) 用領(lǐng)域和效率很重要，是植酸酶研宄的主要方向之一。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明所解決的技術(shù)問(wèn)題是克服現(xiàn)有液體植酸酶的缺陷，無(wú)須添加化學(xué)防腐劑， 無(wú)須低溫處理，將微生物來(lái)源的植酸酶發(fā)酵液和含植酸酶活性較高的麥芽提取液混合發(fā)酵 得到發(fā)酵粗酶液，進(jìn)一步提高了植酸酶的酶活力，在常溫下對(duì)發(fā)酵粗酶液和調(diào)配濃縮液采 用高壓脈沖電場(chǎng)處理，并在調(diào)配過(guò)程添加果膠分解物、中草藥提取物、改性膳食纖維等天然 植物原料，然后除菌過(guò)濾、無(wú)菌灌裝即得一種酶活力高、穩(wěn)定性強(qiáng)的液體植酸酶。
[0007] 為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案：
[0008] 一種液體植酸酶的制備方法，包括如下步驟：
[0009] 1)將發(fā)酵后獲得的植酸酶發(fā)酵液與麥芽提取液按質(zhì)量比5-10:2-4均勻混合， 28-35°C發(fā)酵15-24h，攪拌速度120-180r/m，通風(fēng)量l-3vvm，得到混合發(fā)酵液；
[0010] 2)向混合發(fā)酵液中添加100目-300目硅藻土，用500-800目濾布預(yù)涂硅藻土，采 用板框過(guò)濾機(jī)進(jìn)行過(guò)濾，操作壓力為0. 14-0. 24Mpa，得發(fā)酵粗酶液；
[0011] 所述硅藻土的添加量為每l〇〇mL發(fā)酵液添加0. 8-1. 2g;
[0012] 3)將發(fā)酵粗酶液于室溫下在電場(chǎng)強(qiáng)度30-35kV/cm，脈沖時(shí)間300-500ys，脈沖頻 率200-300HZ條件下進(jìn)行高壓脈沖電場(chǎng)處理；
[0013] 4)步驟3)經(jīng)高壓脈沖電場(chǎng)處理的發(fā)酵粗酶液依次通過(guò)孔徑為0. 4-0. 8ym的微濾 膜微濾和孔徑為〇. 005-0. 015ym的超濾膜超濾，然后循環(huán)超濾得到濃縮酶液；
[0014] 所述微濾進(jìn)口壓力為0? 1-0. 12MPa，壓差0? 07-0. 09MPa，酶液溫度25-30°C;
[0015] 所述超濾進(jìn)口壓力為0? 15-0. 20MPa，壓差0? 08-0.lOMPa，酶液溫度25-35°C;
[0016] 5)向濃縮酶液中加入其質(zhì)量5-12%的穩(wěn)定劑，充分?jǐn)嚢?，均勻混合，用乳酸調(diào)節(jié) pH值2. 5-5. 5,然后于室溫下在電場(chǎng)強(qiáng)度35-40kV/cm，脈沖時(shí)間400-600ys，脈沖頻率 200-300HZ條件下進(jìn)行高壓脈沖電場(chǎng)處理，靜置20-40min;
[0017] 6)將步驟5)經(jīng)調(diào)配、靜置后的濃縮酶液經(jīng)除菌過(guò)濾、無(wú)菌灌裝即得穩(wěn)定的液體植 酸酶。
[0018] 進(jìn)一步地，步驟1)中所述麥芽提取液含有豐富的植物酶系，是以植物中含有相對(duì) 較高植酸酶酶活的小麥麩、小麥芽和大麥芽為原料，采用微波輔助超聲提取和高壓脈沖電 場(chǎng)提取等低溫提取技術(shù)，有效提高了原料利用率、植物酶活性和產(chǎn)率，特別是有效提高了植 酸酶活性；同時(shí)麥芽提取物中還含有植物多糖、單糖和氨基酸等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，不含植物淀粉、 植物蛋白（植物淀粉、植物蛋白等大分子物質(zhì)已被溶出的植物酶在提取過(guò)程中酶解為低 分子多糖和單糖等小分子水解物）。
[0019] 優(yōu)選地，步驟1)中所述麥芽提取液的制備方法為：將大麥芽、小麥芽和小麥麩按 質(zhì)量比1-3:3-5:6-10均勻混合，粉碎至粒徑0. 5-lmm，得粉碎麥芽；加入粉碎麥芽質(zhì)量1-3 倍的水，用乳酸調(diào)節(jié)pH值為3-4,在功率150-300W、頻率2000Hz條件下進(jìn)行微波提取，其 中，每次微波輻照總時(shí)間60-80s，進(jìn)行間隔式輻照：輻照10s，間隔10s，控制溫度20-35°C， 如此輻照10次，同時(shí)在功率200-300W，頻率30-40KHZ條件下進(jìn)行超聲波輔助提取；保溫 l_3h，然后，在功率200-400W、頻率2000Hz條件下進(jìn)行微波提取，其中，每次微波輻照總時(shí) 間90-105S，進(jìn)行間隔式輻照：輻照15s，間隔10s，控制溫度40-60°C，如此輻照10次，同時(shí) 在功率300-500W，頻率40-50KHZ條件下進(jìn)行超聲波輔助提?。?5-65°C保溫30-60min;最 后自然降溫至室溫，于電場(chǎng)強(qiáng)度25-35kV/cm，脈沖時(shí)間400-600ys，脈沖頻率200-300HZ條 件下進(jìn)行高壓脈沖電場(chǎng)提取；提取液過(guò)濾得第一濾液，加濾渣2倍的水漂洗、過(guò)濾得第二濾 液，將第一濾液和第二濾液按質(zhì)量比1:1-3均勻混合即得麥芽提取液；
[0020] 優(yōu)選地，步驟5)中所述穩(wěn)定劑的制備方法如下：按重量份數(shù)計(jì)，準(zhǔn)確稱取果膠分 解物20-30份，中草藥提取物20-30份，改性膳食纖維10-15份，海藻糖8-12份，天然抗氧化 劑5-10份，多元醇2-5份，金屬氯化物1-3份，牛血清白蛋白0. 1-0. 3份；首先取改性膳食纖 維，加入其質(zhì)量5-12倍的去離子水，室溫浸泡4-6h，邊升溫邊攪拌，40-60°C保溫20-30min， 攪拌，充分溶解，繼續(xù)保溫，邊攪拌邊依次加入果膠分解物、中草藥提取物、海藻糖、多元醇、 金屬氯化物，然后降溫至25-35°C，邊攪拌邊依次加入牛血清白蛋白、天然抗氧化劑均勻混 合即得穩(wěn)定劑；
[0021] 所述果膠分解物具有顯著的抑菌特性，尤其對(duì)大腸桿菌抑制作用最強(qiáng)，同時(shí)還具 有較強(qiáng)的抗氧化性，濃度達(dá)到〇. 01 %時(shí)即可作用，對(duì)超氧自由基、羥自由基和DPPH自由基 都表現(xiàn)出很強(qiáng)的消除作用，當(dāng)濃度達(dá)到1.0%時(shí)，消除效果達(dá)到100% ;
[0022] 進(jìn)一步地，所述果膠分解物是以檸檬、橙、柚、柑桔、葡萄等果皮或山楂、甜菜、蘋 果等廢渣經(jīng)超聲清洗、高壓脈沖提取、熱水浸提、醇沉獲得果膠，然后經(jīng)果膠酶酶解而制得 的；
[0023] 優(yōu)選地，所述果膠分解物的制備方法為：將新鮮的山楂果渣、柑桔皮、蘋果渣分別 放入裝有1.2%碳酸氫鈉溶液的超聲波清洗機(jī)中于2001、401(抱清洗5-101^11，瀝干，切分成 相等規(guī)格，長(zhǎng)、寬為5-10mm，厚度3-5mm的片或丁，按質(zhì)量比4-7:2-4:1-3均勻混合，然后 于-21--25°C冷凍10_30min;立即進(jìn)行粉碎，粒徑為0. 1-lmm;加入粉碎物質(zhì)量3-5倍的去 離子水，混合均勾，用梓檬酸調(diào)節(jié)pH值為2-3,于