基于dna鏈取代循環(huán)放大技術檢測dna甲基轉(zhuǎn)移酶活性的比色傳感方法
【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及一種基于DNA鏈取代循環(huán)放大技術檢測DNA甲基轉(zhuǎn)移酶活性的比色傳感方法，屬于比色傳感技術領域。
【背景技術】
[0002]DNA甲基化在很多正常細胞的生長過程包括細胞分化、轉(zhuǎn)錄沉默、基因調(diào)控、X染色體失活和一些其它過程中扮演著非常重要的角色。不同的甲基轉(zhuǎn)移酶會導致不同的異常DNA甲基化，DNA甲基化與很多基因疾病和癌癥密切相關，使得DNA甲基轉(zhuǎn)移酶成為多種癌癥治療的潛在靶向目標和生物標志物。在惡性腫瘤中，甲基轉(zhuǎn)移酶活性的異常一般都比其它的現(xiàn)象先顯現(xiàn)出來，因而可以用于癌癥的早期診斷。所以，發(fā)展靈敏的甲基轉(zhuǎn)移酶活性檢測方法對癌癥的診斷和治療是非常必要的。DNA甲基轉(zhuǎn)移酶活性檢測的傳統(tǒng)方法有放射性標記法、液相色譜/質(zhì)譜法、高效毛細管電泳、熒光法、比色法、電化學法、電致化學發(fā)光法和化學發(fā)光法，但是，仍然存在放射性標記物污染、昂貴的抗體或熒光標記、大型的檢測設備、樣品準備和數(shù)據(jù)分析耗時費力等問題。因此，需要發(fā)展更簡單靈敏的DNA甲基轉(zhuǎn)移酶活性檢測方法。
[0003]AuNPs有高的消光系數(shù)和強的尺寸依賴的表面等離子體共振(SPR)特性，其分散和團聚狀態(tài)使得AuNPs溶液的顏色可由紅色變成藍色，此過程伴隨著SPR特征的變化，因其顏色和吸光度變化明顯，AuNPs成為設計比色傳感平臺的理想納米材料。但是，AuNPs比色法的檢測靈敏度較低，所以發(fā)展基于放大技術的AuNPs比色方法非常必要。DNA鏈取代反應發(fā)生在兩鏈不等長的雙鏈DNA和單鏈DNA之間，它們把立足點當做引發(fā)位置，使得DNA以“點對點”可控程序方式進行快速重組。這樣的優(yōu)勢之一是由于取代反應發(fā)生在已經(jīng)設計好的位置上，因此鏈取代的路線可以被預測。此外，參與反應的所有寡核苷酸序列都是已知的，所有可能出現(xiàn)的差錯如鏈取代過程中的缺失、插入、或點突變等都能考慮進來，因此，可以預測動力學、熱力學和置換反應的結(jié)果。然而，尚未見DNA鏈取代放大技術與AuNPs相結(jié)合用于檢測DNA甲基轉(zhuǎn)移酶活性的比色傳感方法的報道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的在于發(fā)展一種基于DNA鏈取代循環(huán)放大技術檢測DNA甲基轉(zhuǎn)移酶活性的比色傳感方法，它具有檢測靈敏和簡單快速的優(yōu)點。
[0005]本發(fā)明是這樣實現(xiàn)的，一種基于DNA鏈取代循環(huán)放大技術檢測DNA甲基轉(zhuǎn)移酶活性的比色傳感方法，其特征在于包括以下步驟:
(I)制備AuNPs:在圓底燒瓶中加入49 mL超純水和I mL質(zhì)量百分濃度為2%的HAuCl4.3H20溶液，加熱使之沸騰后，加入I mL質(zhì)量百分濃度為5%的檸檬酸三鈉溶液，持續(xù)攪拌并保持沸騰5分鐘后，攪拌下使溶液自然冷卻至室溫，即制備成粒徑13 nm且濃度為12 nM的AuNPs，在4 0C保存?zhèn)溆茫? (2 )制備AuNPs標記的探針DNA:將5.5 nM活化后的探針DNA加入到3 mL步驟(I)制備的AuNPs溶液中，室溫下在搖床上震蕩12小時，加入磷酸調(diào)節(jié)溶液中磷酸根的濃度為9mM，30分鐘后，加入磷酸鹽緩沖溶液，在隨后的兩天內(nèi)分六次繼續(xù)加入磷酸鹽緩沖溶液，使NaCl的最終濃度為0.3 mM，陳化過夜。在轉(zhuǎn)速15000 rpm下離心15 min，去除上清液，將沉淀分散在三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽緩沖溶液中離心并清洗3次，去除未與Au NPs反應的探針DNA。將修飾好了的DNA-AuNPs分散在2 mL三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽緩沖溶液中，在4°(:冰箱中保存?zhèn)溆茫?br> (3)比色傳感方法:將20yL的lXNEBuffer2緩沖溶液、80 μMS-腺苷甲硫氨酸(SAM),40 nM發(fā)夾DNA I以及不同濃度的M.SssI混合，在37 ° C水浴中反應5小時，使得發(fā)夾DNA I部分發(fā)生甲基化；將混合物在65。C水浴中加熱20分鐘使M.SssI失活，再加入Hpall，在37 ° C恒溫水浴中反應2小時，將未發(fā)生甲基化的發(fā)夾DNA I剪切為單鏈DNA碎片；向溶液中加入發(fā)夾DNA 11和探針DNA修飾的AuNPs，在37 ° C水浴中反應90分鐘，DNA碎片中的reg1n I可與發(fā)夾DNA II雜交形成雙鏈，DNA II進而與步驟(2)制備的AuNPs標記的兩種探針DNA雜交，使得AuNPs被DNA II連接在一起，而取代出來的reg1n I繼續(xù)與發(fā)夾DNA II雜交進入下一個鏈替換循環(huán)，如此循環(huán)，使得大量AuNPs發(fā)生聚集，溶液顏色由紅色變淺甚至變成藍色；用三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽緩沖溶液將反應液稀釋到350μL測定紫外吸收光譜；
(4)M.SssI活性檢測:隨著Μ.SssI濃度的增大，發(fā)生甲基化的發(fā)夾DNA I增多，不能被HpaII剪切的發(fā)夾DNA I增多，分散的AuNPs就多，使得吸光度逐漸增大，Μ.SssI濃度的對數(shù)在0.l-50U/mL范圍內(nèi)與吸光度呈良好的線性，檢出限為0.04 U/mL。
[0006]上述步驟中，步驟(2)中，所述的磷酸鹽緩沖溶液均為濃度10 mM、pH 7.0、含2 MNaCl。步驟(2)和步驟(3)中，所述的三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽緩沖溶液均為濃度為10禮、pH為7.4，含50 mMNaCl。步驟(3)中，I XNEBuffer2緩沖溶液的組成為10 mM三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽、50 mMNaClUO mM MgCl2U mM 二流蘇糖醇，pH為7.9。步驟(3)中，所有的發(fā)夾DNA在使用前均在90。C水浴中加熱10分鐘再冷卻到室溫，進行退火雜交。
[0007]本發(fā)明的技術效果是:本發(fā)明利用DNA鏈取代循環(huán)放大技術和金膠聚集變色原理，發(fā)展了一種用于檢測DNA甲基轉(zhuǎn)移酶活性的比色傳感方法，此方法具有簡單方便的可視化檢測、DNA鏈取代放大檢測信號、靈敏度高、檢測限低和選擇性好等特點。
【附圖說明】
[0008]圖1是基于DNA鏈取代循環(huán)放大技術檢測M.SssI活性的原理圖。
[0009]圖 2 是(a) DNAl/Γ-AuNPs+DNA I+M.Sssl+Hpall，(b) DNAl/1’-AuNPs+DNA I+HpaII， (c)DNA1/1’-AuNPs+DNA I+DNAII， (d)DNAl/Γ -AuNPs+DNAI+M.SssI+Hpall+DNAII，(e) DNA1/1' -AuNPs+DNAI+M.SssI (失活)+HpaII+DNAII, (f)DNAl/1’ -AuNPs+DNAI+HpalI+DNAII 的紫外-可見吸收光譜圖。
[0010]圖3 是在 SAM+HpaII+DNAI+DNAII+DNAl/1’ -AuNPs 樣品中，(A)存在M.SssI 和(B)不存在M.SssI時AuNPs的TEM圖。
[0011]圖4是DNA鏈取代放大實驗條件的優(yōu)化！(A)DNAI濃度，(B) DNA1:DNAII, (C) SAM濃度，(D) HpaII濃度。
[0012]圖 5 是⑷在 DNAl/1’ -AuNPs+DNAI+HpaII+DNAII 溶液中加入 M.SssI (O, 0.1,0.2, 0.5, I, 5，10，20，30，40，50，80，120 U/mL)時的紫外-可見吸收光譜圖。(B)A/^與M.SssI濃度的對應關系，內(nèi)插圖是A/^與 1gC M sssI的線性關系。
[0013]圖6是比色傳感方法的選擇性。M.SssI和Dam甲基轉(zhuǎn)移酶均為50 U/mL，對照樣品中M.SssI的濃度為O U/mL ο
【具體實施方式】
[0014]下面結(jié)合附圖和具體實施例對本發(fā)明作進一步闡述，本發(fā)明并不限于此；
實施例1
(I)制備AuNPs:在圓底燒瓶中加入49 mL超純水和I mL質(zhì)量百分濃度為2%的HAuCl4.3H20溶液，加熱使之沸騰后，加入I mL質(zhì)量百分濃度為5%的檸檬酸三鈉溶液，持續(xù)攪拌并保持沸騰5分鐘后，攪拌下使溶液自然冷卻至室溫，即制備成粒徑13 nm且濃度為12 nM的AuNPs，在4 0C保存?zhèn)溆茫?br> (2 )制備AuNPs標記的探針DNA:將5.5 nM活化后的探針DNA加入到3 mL步驟(I)制備的AuNPs溶液中，室溫下在搖床上震蕩12小時，加入磷酸調(diào)節(jié)溶液中磷酸根的濃度為9mM，30分鐘后，加入磷酸鹽緩沖溶液，在隨后的兩天內(nèi)分六次繼續(xù)加入磷酸鹽緩沖溶液，使NaCl的最終濃度為0.3 mM，陳化過夜。在轉(zhuǎn)速15000 rpm下離心15 min，去除上清液，將沉淀分散在三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽緩沖溶液中離心并清洗3次，去除未與Au NPs反應的探針DNA。將修飾好了的DNA-AuNPs分散在2 mL三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽緩沖溶液中，在4°(:冰箱中保存?zhèn)溆茫?br> (3)比色傳感方法:將20 μ L的I XNEBuffer2緩沖溶液、80 μ M SAM,40 nM發(fā)夾DNAI以及不同濃度的M.SssI混合，在37 ° C水浴中反應5小時，使得發(fā)夾DNA I部分發(fā)生甲基化；將混合物在65 ° C水浴中加熱20分鐘使M.SssI失活，再加入Hpall，在37 ° C恒溫水浴中反應2小