oA基因的⑶S序列。沉 積物中總基因 DNA以1~IOng的水平作為模板加入每個(gè)反應(yīng)混合物中。按照表2配制PCR 反應(yīng)體系。
[0122] 表2 PCR反應(yīng)體系配方
[0123]
[0124] 用無(wú)菌CldH2O代替DNA作為陰性對(duì)照。操作過(guò)程均在冰浴中進(jìn)行。采用 LightCycler480 Software 1. 5. 0軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。
[0125] RT-PCR 反應(yīng)條件：
[0127] 其中，PCR反應(yīng)體系的配制在本發(fā)明原態(tài)微生物油氣與水合物勘探工作站（isMOST Station 1)中完成。操作流程如下：
[0128] SI.按照表2配制好的反應(yīng)體系混合液（除了 2 μ L DNA模板），分裝于2ml滅菌 離心管中，每管大于0. 5ml，置于制冷保存的載物架中。
[0129] S2.將原態(tài)微生物油氣與水合物勘探工作站（isMOST Station 2)提取和純化的 帶核酸樣品的深孔板一起置于載物架中，作為DNA模板。
[0130] S3.執(zhí)行原態(tài)微生物油氣與水合物勘探工作站（isMOST Station 1)設(shè)定的程序， 將建立PCR反應(yīng)體系所需的混合試劑和2 μ L DNA模板依次加入對(duì)應(yīng)的、新的深孔板中，即 完成PCR反應(yīng)體系的配置。
[0131] 后續(xù)步驟參照文獻(xiàn)（邵明瑞等，2013,三種油氣指示菌定量PCR方法的建立及其 在油氣田土壤中的初步應(yīng)用，生物技術(shù)通報(bào)，第4期，172-178)進(jìn)行操作，實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，用 LightCycler 480 Software 1.5. 0軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析，即可獲得樣品中甲燒氧化菌 的豐度。
[0132] 實(shí)施例4本發(fā)明自動(dòng)化工作站工作性能測(cè)試
[0133] 1.樣品處理能力
[0134] 從本發(fā)明檢測(cè)系統(tǒng)運(yùn)行記錄總結(jié)出，處理96個(gè)海洋沉積物平行樣的起始時(shí)間是 11點(diǎn)06分26秒，終止時(shí)間是12點(diǎn)46分03秒，約耗時(shí)1小時(shí)40分（即100分鐘）；本發(fā)明 檢測(cè)系統(tǒng)按每天運(yùn)行8小時(shí)，則每天可處理樣品數(shù)=(8小時(shí)X60分/小時(shí)）X96個(gè)/100 分]= 461個(gè)；每年運(yùn)行時(shí)間按300天計(jì)，則本發(fā)明檢測(cè)系統(tǒng)每年可處理樣品13. 83萬(wàn)個(gè)。
[0135] 2.提取核酸的效果
[0136] 從上述獲得的96個(gè)核酸樣品中任意選取9個(gè)樣品進(jìn)行PCR擴(kuò)增，其電泳圖如圖4 所示。為了進(jìn)行核酸提取效果的對(duì)比，將手工處理陸地土壤樣品中細(xì)菌的電泳圖展示于圖 5中。對(duì)比圖4和圖5可以明顯看出：
[0137] (1)用本發(fā)明檢測(cè)系統(tǒng)提取的核酸質(zhì)量很高，且非常穩(wěn)定及具有可重復(fù)性（見(jiàn)圖4 中的1至9灰白色條帶）；
[0138] (2)本發(fā)明檢測(cè)系統(tǒng)核酸純化得非常好（圖4中灰白色條帶的亮度基本一致），這 與圖5中明顯不同（圖5a :核酸沒(méi)有提取出來(lái)；圖5b :核酸雖然提取出來(lái)，但具有從很亮至 逐漸變暗的帶狀變異趨勢(shì)，反映出核酸純化得不好）；
[0139] (3)從樣品中擴(kuò)增出的細(xì)菌條帶與M條帶（標(biāo)志物Marker)之間的距離可以看出， 用手工提取的細(xì)菌核酸，其分子量大致在2萬(wàn)左右（圖5);而用本發(fā)明檢測(cè)系統(tǒng)提取的細(xì) 菌核酸，其分子量大致在20萬(wàn)左右（圖5)，反映出用本發(fā)明檢測(cè)系統(tǒng)提取核酸不容易水解， 這為后續(xù)對(duì)細(xì)菌的豐度進(jìn)行熒光定量提供了更佳的樣品，會(huì)使定量精度更高、更準(zhǔn)確。
[0140] (4)本發(fā)明檢測(cè)系統(tǒng)同時(shí)能提供試驗(yàn)過(guò)程的真實(shí)記錄，使所獲得的數(shù)據(jù)不僅具有 可追溯性，且因其具有相同誤差，故能對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)一的誤差校正。
[0141] 3.同一樣品的對(duì)比實(shí)驗(yàn)
[0142] 按照本發(fā)明方法以及采用現(xiàn)有常規(guī)的手工提取的方法提取同一個(gè)海洋沉積物樣 品所得提取核酸效果的比較結(jié)果列于表3 :
[0143] 表 3
[0144]
[0145] *海水之下沉積物的深度。
[0146] 從上表3看出：（1)用本發(fā)明方法提取核酸的效率明顯比手工提取的效率高，平均 高出約14% ; (2)用本發(fā)明方法提取核酸的穩(wěn)定性（誤差約為0. 3% )明顯比手工提取核 酸的穩(wěn)定性（誤差約為7. 6% )好。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種甲烷氧化菌豐度的自動(dòng)化檢測(cè)方法，其特征在于，包括以下步驟：51. 構(gòu)建原態(tài)微生物油氣與水合物勘探技術(shù)的自動(dòng)化工作站；所述工作站包括自動(dòng)液 體處理裝置、核酸提取設(shè)備、PCR反應(yīng)體系配置系統(tǒng)；52. 樣品處理，每個(gè)樣品得到大于I. 5 ml的上清液；53. 采用本發(fā)明原態(tài)微生物油氣與水合物勘探工作站自動(dòng)液體處理裝置完成移液；具 體是執(zhí)行自動(dòng)液體處理裝置設(shè)定的程序，將不同的試劑通過(guò)自動(dòng)控制機(jī)械臂上移液通道和 移液模塊的動(dòng)作自動(dòng)加入對(duì)應(yīng)的樣品板、結(jié)合板、洗滌板和洗脫板中；54. 自動(dòng)核酸提取設(shè)備提取與純化DNA，將所有的樣品板都準(zhǔn)備好后，執(zhí)行本發(fā)明原態(tài) 微生物油氣與水合物勘探工作站設(shè)定程序，得到土壤和/或沉積物中的總基因組DNA ;核酸 提取與純化流程結(jié)束后經(jīng)自動(dòng)液體處理裝置將樣品的核酸提取液移轉(zhuǎn)移至微量PCR管中， 標(biāo)記清楚后于-20 °C冰箱中保存；55. 瓊脂糖電泳檢測(cè)；56. 經(jīng)實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)，獲得甲烷氧化菌豐度。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述甲烷氧化菌豐度的自動(dòng)化處理方法，其特征在于，S5步驟所述 瓊脂糖電泳檢測(cè)操作方法如下： (1) 取5 W DNA提取液于1%瓊脂糖上電泳鑒定，DNA Ladder為DL2000 ; (2) 若有> 2 kbp條帶，則取5 W DNA提取液加滅菌水稀釋20倍后作為PCR模板并在 4°C下保存，樣品基因組DNA提取液保存于-20 °C。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述甲烷氧化菌豐度的自動(dòng)化檢測(cè)方法，其特征在于，S6步驟所述 甲烷氧化菌豐度的熒光定量PCR檢測(cè)包括以下步驟： (1) 甲烷氧化菌的培養(yǎng)； (2) 設(shè)計(jì)特異性引物； (3) 制備標(biāo)準(zhǔn)品； (4) 建立實(shí)時(shí)熒光定量PCR的反應(yīng)體系和反應(yīng)條件； 其中，PCR反應(yīng)體系的配制在本發(fā)明原態(tài)微生物油氣與水合物勘探工作站中完成； 操作流程如下：561. 按照配制好反應(yīng)體系混合液，經(jīng)自動(dòng)液體處理裝置分裝于滅菌離心管中，每管大 于0.5 ml，置于制冷保存的載物架中；562. 將原態(tài)微生物油氣與水合物勘探工作站提取與純化的帶核酸樣品的深孔板一起 置于載物架中，作為DNA模板；563. 執(zhí)行原態(tài)微生物油氣與水合物勘探工作站設(shè)定的程序，將建立PCR反應(yīng)體系所需 的混合試劑和DNA模板依次加入對(duì)應(yīng)的、新的深孔板中，即完成PCR反應(yīng)體系的配置； (5) 對(duì)樣品進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)，分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果，即可獲得樣品中甲烷氧化菌的 豐度。4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述甲烷氧化菌豐度的自動(dòng)化檢測(cè)方法，其特征在于，步驟（2)所述 引物序列為： F: 5' -CTGGCAGGGCATTCAGGATT-3' ； S: 5'-GAAGAAGGGCGTCAGCGTGT-3'。
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種甲烷氧化菌豐度的自動(dòng)化檢測(cè)方法。包括構(gòu)建原態(tài)微生物油氣與水合物勘探技術(shù)的自動(dòng)化工作站、樣品處理、采用工作站自動(dòng)液體處理裝置完成移液、自動(dòng)核酸提取設(shè)備提取與純化DNA、瓊脂糖電泳檢測(cè)、甲烷氧化菌豐度的實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)、獲得其豐度結(jié)果等步驟。本發(fā)明基于自動(dòng)分析方法，使甲烷氧化菌的核酸提取與純化步驟實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化；使其特異基因PCR反應(yīng)體系的配制實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化，減少手工操作引入的人為因素所造成的誤差，操作步驟在潔凈環(huán)境中運(yùn)行，整個(gè)檢測(cè)過(guò)程通過(guò)計(jì)算機(jī)軟件控制，檢測(cè)流程可以追溯，可實(shí)現(xiàn)系統(tǒng)誤差的統(tǒng)一校正。
【IPC分類】C12Q1/06, C12Q1/68
【公開(kāi)號(hào)】CN105018609
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510400780
【發(fā)明人】王江海, 徐貴新, 安合義, 徐小明, 鄭新寧, 徐小燕
【申請(qǐng)人】廣州安能特化學(xué)科技有限公司
【公開(kāi)日】2015年11月4日
【申請(qǐng)日】2015年7月9日