FlP-tvc基因的核苷酸序列是，在不改變?cè)浦ッ庖哒{(diào)節(jié)蛋白FlP-tvc氨基酸序列的基礎(chǔ)上，按照畢赤酵母偏好性密碼子對(duì)FlP-tvc全基因序列進(jìn)行優(yōu)化并合成，同時(shí)在5’端和3’端引入酶切位點(diǎn)，在3’端的終止密碼子前加入蛋白質(zhì)標(biāo)簽序列方便后續(xù)的蛋白質(zhì)純化，蛋白質(zhì)標(biāo)簽為eGFP、His、Flag、谷胱甘肽的一種。
[0015]步驟(2)中所述的構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒載體pGAPZ a A-FIP-tvc或pPICZ a A-FIP-tvc,方法是，將合成的基因序列與質(zhì)粒載體存U用限制性內(nèi)切酶進(jìn)行雙酶酶切，回收目的片段，利用T4 DNA連接酶將的酶切片段與質(zhì)粒i酶切片段連接，得到重組表達(dá)質(zhì)粒X-FIP-tvc,轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5 α中進(jìn)行擴(kuò)增；
所述的雙酶酶切是利用限制性內(nèi)切酶EcoR I和XAa I將步驟(I)中合成的云芝免疫調(diào)節(jié)蛋白基因與組成型表達(dá)質(zhì)粒載體pGAPZ a A或誘導(dǎo)型表達(dá)質(zhì)粒載體pPICZ a A進(jìn)行雙酶酶切，凝膠電泳分離后回收目標(biāo)DNA片段，然后利用T4 DNA連接酶對(duì)DNA片段進(jìn)行16°C連接過(guò)夜，42°C熱擊轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a感受態(tài)細(xì)胞，涂布含25 μ g/mL Zeocin的LB培養(yǎng)基平板，置于37°C下培養(yǎng)過(guò)夜，隨機(jī)挑取單克隆，抽提重組表達(dá)質(zhì)粒pGAPZ a A-FIP-tvc或pPICZ a A-FIP-tvc，通過(guò)雙酶酶切鑒定陽(yáng)性克隆子，LB培養(yǎng)基是由5g酵母抽提物、1g蛋白胨、5g氯化鈉，調(diào)節(jié)pH值至7.2-7.4，加水至100mL制成。
[0016]步驟(3)中所述的轉(zhuǎn)化畢赤酵母GS115感受態(tài)細(xì)胞，方法是，采用電擊轉(zhuǎn)化或化學(xué)轉(zhuǎn)化，電擊轉(zhuǎn)化是利用限制性內(nèi)切酶對(duì)構(gòu)建的重組質(zhì)粒進(jìn)行酶切線性化，用電轉(zhuǎn)化儀電擊轉(zhuǎn)化畢赤酵母菌株感受態(tài)細(xì)胞；化學(xué)轉(zhuǎn)化是利用平板篩選陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子，在含相應(yīng)抗生素的YPD平板篩選獲得陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子或通過(guò)MM平板、MD平板篩選獲得營(yíng)養(yǎng)缺陷型或基因型轉(zhuǎn)化子；
所述的YB)平板是由:10g酵母粉、20g蛋白胨、20gD-葡萄糖、瓊脂15g，加水至100mL制成；
所述的MM平板是由:13.4g無(wú)氨基酸酵母氮源(YNB)、4X 10-4g生物素、5mL甲醇、瓊脂15.0g，加水至100mL制成；
所述的MD平板是由:13.4g無(wú)氨基酸酵母氮源(YNB)、4X 10-4g生物素、20g D-葡萄糖、瓊脂15g，加水至100mL制成。
[0017]步驟(3)中所述的對(duì)重組表達(dá)質(zhì)粒載體X-FIP-tvc進(jìn)行線性化是，利用限制性內(nèi)切酶AktII酶切組成型重組表達(dá)質(zhì)粒pGAPZ a A_FIP_tvc，或限制性內(nèi)切酶S ac I酶切誘導(dǎo)型重組表達(dá)質(zhì)粒pPICZ a A-FIP-tvc進(jìn)行線性化，分別取5_20 μ g質(zhì)粒進(jìn)行電擊轉(zhuǎn)化畢赤酵母 GS115 感受態(tài)細(xì)胞，所用 GenePulseXcell 電轉(zhuǎn)化儀(B1-Rad laboratories Inc.)的參數(shù)是:電壓1.8kV，電容25 μ F，電阻200 Ω，放電時(shí)間4.8-5.2ms，電擊后立即加入1.0mL冰冷的1.0M山梨醇，30°C振蕩培養(yǎng)l_2h后涂布含100 μ g/mL Zeocin的YPD平板，置于28-30°C培養(yǎng)2-4d后長(zhǎng)出轉(zhuǎn)化子，將轉(zhuǎn)化子接種到含100 μ g/mL Zeocin的YI3D液體培養(yǎng)基中置于28-30 0C下200rpm振蕩培養(yǎng)3d后，8000rpm離心5min，收集菌體，提取轉(zhuǎn)化子的基因組DNA ;以獲得的基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，所用引物按畢赤酵母表達(dá)載體的序列設(shè)計(jì)，上游通用引物a -factor為5’ -TACTATTGCCAGCATTGCTGC-3’，下游通用引物3’ -A0X1為 5’-GCAAATGGCATTCTGACATCC-3’；PCR 反應(yīng)體系采用 25 μ L:10XPCR buffer 2.5 μ L，dNTP 2.0yL，上下游引物各 1.0 yL，模板 DNA 2.0 yL，rTaq 酶 0.3 yL，補(bǔ)充 ddH20 至
25.0 μ Lo PCR擴(kuò)增條件為94°C預(yù)變性5 min，然后進(jìn)入循環(huán)94°C 40 s，54°C30 s，72°C60s，進(jìn)行30個(gè)循環(huán)，最后72°C最終延伸lOmin，擴(kuò)增產(chǎn)物用1.2%瓊脂糖電泳觀察結(jié)果，出現(xiàn)目標(biāo)條帶的為陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子。
[0018]步驟(4)中所述的篩選獲得的組成型分泌表達(dá)rFIP-tvc的畢赤酵母重組菌株或誘導(dǎo)型分泌表達(dá)rFIP-tvc的畢赤酵母重組菌株，其中組成型分泌表達(dá)rFIP-tvc的畢赤酵母重組菌株用YH)培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)；所述的誘導(dǎo)型分泌表達(dá)rFIP-tvc的畢赤酵母重組菌株是，在平板挑取轉(zhuǎn)化子接種于培養(yǎng)基中，通過(guò)搖瓶發(fā)酵誘導(dǎo)表達(dá)，獲得高分泌表達(dá)FlP-tvc的畢赤酵母菌株。其中:所述的培養(yǎng)基包括BMGY/BMMY、BMG/BMM、YPG ;其中優(yōu)選BMGY/BMMY和YPG培養(yǎng)基；
所述的BMGY培養(yǎng)基是:1g酵母粉、20g蛋白胨、10mM磷酸緩沖液(pH 6.0),13.4g無(wú)氨基酸酵母氮源(YNB)、4X 10 4g生物素、1mL甘油，加水至100mL制成:
所述的BMMY培養(yǎng)基是:1g酵母粉、20g蛋白胨、10mM磷酸緩沖液(pH6.0)、13.4g無(wú)氨基酸酵母氮源(YNB)、4X 10 4g生物素、5mL甲醇，加水至100mL制成:
所述的BMG培養(yǎng)基是:100mM磷酸緩沖液(pH6.0)、13.4g無(wú)氨基酸酵母氮源(YNB)、4 XlO4g生物素、1mL甘油，加水至100mL制成:
所述的BMM培養(yǎng)基是:100mM磷酸緩沖液(pH6.0)、13.4g無(wú)氨基酸酵母氮源(YNB)、4XlO4g生物素、5mL甲醇，加水至100mL制成:
所述的YPG培養(yǎng)基是:10g酵母粉、20g蛋白胨、1mL甘油，加水至100mL制成。
[0019]步驟(5)中所述的從發(fā)酵培養(yǎng)液中分離純化重組云芝免疫調(diào)節(jié)蛋白rFIP-tvc是:將獲得的高水平表達(dá)重組蛋白的畢赤酵母菌株發(fā)酵培養(yǎng)后，發(fā)酵液經(jīng)離心得到上清液，用硫酸銨沉淀蛋白質(zhì)，經(jīng)離心后獲得蛋白質(zhì)沉淀，沉淀部分用平衡緩沖液重新溶解后用相同的緩沖液進(jìn)行透析24-48h，其間換透析液3次以上，根據(jù)表達(dá)的重組蛋白選擇帶有His標(biāo)簽的N1-NTA層析柱，將蛋白粗提液首先上N1-NTA層析柱，用平衡緩沖液洗脫掉未能結(jié)合到柱上的蛋白，然后分別用不同PH值或含有不同鹽離子濃度的平衡緩沖液進(jìn)行洗脫，收集洗脫液，應(yīng)用聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)電泳檢測(cè)蛋白的純化效果，采用透析的方法或用脫鹽柱洗脫的方式除鹽，真空冷凍干燥或噴霧干燥，得純化后的固體rFIP-tvc粉末。
[0020]將具有高分泌表達(dá)rFIP-tvc的畢赤酵母重組菌株進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)或誘導(dǎo)表達(dá)3-7d，在8000rpm、4°C對(duì)發(fā)酵液離心5min，收集上清液，用80%硫酸錢(qián)進(jìn)行沉淀過(guò)夜，然后以20000 rpm、4°C離心30min后棄上清液，沉淀用平衡緩沖液進(jìn)行溶解，用平衡緩沖液，截留分子量3.5kD的透析膜進(jìn)行透析平衡24-48h ;
所述平衡緩沖液是:300mM氯化鈉，50mM磷酸二氫鈉，1mM咪挫，1mM Tris-HCl,ρΗ8.0 ；
用平衡緩沖液平衡N1-NTA層析柱10個(gè)柱體積，將上述透析平衡后的蛋白樣品上柱，進(jìn)行親和交換層析，樣品上柱完畢后，繼續(xù)用平衡緩沖液沖洗20個(gè)柱體積，接著分別用含有100,200,400和100mM咪唑濃度的平衡緩沖液進(jìn)行梯度分段洗脫，收集洗脫液，即獲得純化后的重組蛋白rFIP-tvc，用透析或用脫鹽柱洗脫的方式除鹽，真空冷凍干燥或噴霧干燥，得固體的rFIP-tvc粉末。
[0021]由上述可以看出，本發(fā)明包括兩部分:云芝免疫調(diào)節(jié)蛋白FlP-tvc表達(dá)體系的構(gòu)建和重組云芝免疫調(diào)節(jié)蛋白rFIP-tvc的分離純化，具體是:
1、云芝免疫調(diào)節(jié)蛋白FlP-tvc表達(dá)體系的構(gòu)建
(I)按照畢赤酵母偏好性密碼子人工合成優(yōu)化的云芝免疫調(diào)節(jié)蛋白FlP-tvc基因序列按照畢赤酵母偏好性密碼子，對(duì)云芝免疫調(diào)節(jié)蛋白FlP-tvc全基因序列優(yōu)化后進(jìn)行人工合成，并在FlP-tvc基因的5’端引入Ec0R I酶切位點(diǎn)，3’端終止密碼子前引入6個(gè)組氨酸(His)編碼基因，同時(shí)在終止密碼子后引入XAa I酶切位點(diǎn)。優(yōu)化后的FlP-tvc基因序列如SEQ ID N0.1所示(合成基因序列由北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司完成)。
[0022](2)構(gòu)建組成型重組表達(dá)質(zhì)粒pGAPZ a A_FIP_tvc和誘導(dǎo)型重組表達(dá)質(zhì)粒pPICZa A-FIP-tvc
利用限制性內(nèi)切酶EcoR I和XAa I將步驟(I)中合成的云芝免疫調(diào)節(jié)蛋白基因AiP-1KC與組成型表達(dá)質(zhì)粒載體pGAPZ a A或誘導(dǎo)型表達(dá)質(zhì)粒載體pPICZ a A進(jìn)行雙酶酶切，凝膠電泳分離后回收目標(biāo)DNA片段，然后利用T4 DNA連接酶對(duì)DNA片段進(jìn)行16°C連接過(guò)夜，42°C熱擊轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a感受態(tài)細(xì)胞，涂布LB培養(yǎng)基平板(含25 μ g/mLZeocin)，置于37°C下培養(yǎng)過(guò)夜。隨機(jī)挑取單克隆，抽提重組表達(dá)質(zhì)粒pGAPZ a A-FIP-tvc或pPICZ a A-FIP-tvc，通過(guò)雙酶酶切鑒定陽(yáng)性克隆子。圖1所示為構(gòu)建的重組云芝免疫調(diào)節(jié)蛋白FlP-tvc組成型表達(dá)質(zhì)粒載體pGAPZ a A-FIP-tvc示意圖，圖2所示為構(gòu)建的重組云芝免疫調(diào)節(jié)蛋白FlP-tvc誘導(dǎo)型表達(dá)質(zhì)粒載體pPICZ a A-FIP-tv