一種銀杏品種分子檢測引物組合物及其品種檢測方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于植物新品種鑒定技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種銀杏品種分子檢測引物組合物及 其品種檢測方法，專用于銀杏果用品種的快速分子檢測和鑒定。
【背景技術(shù)】
[0002] 銀杏（GinkgobiIobaL)是現(xiàn)存的種子植物中最古老的物種，被譽為歷 史和現(xiàn)實的珍稀紐帶[Hui-LinL.Ginkgo-themaidenhairtree[J].Amer.Hort. Mag，1961，40:239-249.]。它具有樹體高大挺拔、樹形姿態(tài)多變優(yōu)美、壽命極長等特點，同時 又集果、葉、材等用途于一身，具有較高的經(jīng)濟、生態(tài)和文化價值[曹福亮.中國銀杏志[M]. 中國林業(yè)出版社，2007.]。中國作為世界銀杏的分布中心，擁有世界銀杏種質(zhì)資源90%以 上。隨著其價值的不斷被發(fā)現(xiàn)，自20世紀(jì)80年代，銀杏的良種選育與推廣逐漸受到重視， 就目前為止銀杏栽培品種可以分為核用品種、葉用品種、雄株品種、觀賞品種和材用品種5 大類[刑世巖.中國銀杏種質(zhì)資源[M].中國林業(yè)出版社.2013]。其中，銀杏核用品種較 多，其分類多依據(jù)其來源以及某些種子特征，未有一個較為系統(tǒng)的分類方法，且品種命名方 面也較為隨意，存在同名異物或異名同物的現(xiàn)象，為銀杏品種鑒定造成諸多不便。
[0003] 傳統(tǒng)的植物品種鑒定是基于形態(tài)學(xué)水平的，主要通過植物的某些表型特征對其加 以區(qū)分與鑒定，該方法在品種較少、表型特征差異明顯時較為可行。隨著品種數(shù)目的不斷增 加，品種間差異逐漸縮小，且表型特征有時會隨著環(huán)境的改變而發(fā)生變化，單獨依靠形態(tài)學(xué) 水平已很難達(dá)到對品種有效鑒定的目的了。我國銀杏品種繁多且用途廣泛，而近年來所選 育的品種也多為核用品種，且選育手段集中為選擇育種和無性系育種[郝明灼，曹福亮， 汪貴斌，等.銀杏雜交育種研究現(xiàn)狀及展望[J].林業(yè)科技開發(fā)，2006, 19 (6) : 5-8.]，使得 各品種間的差異越來越小，為銀杏品種區(qū)分增加了難度。此外，在栽培過程中也出現(xiàn)了不少 變異品種，銀杏優(yōu)良品種交易市場上也常有假冒偽劣品種濫竽充數(shù)。一系列問題的出現(xiàn)使 銀杏優(yōu)良品種有效鑒定方法的建立顯得越發(fā)重要。因此，現(xiàn)急需一種快速、方便、可靠的銀 杏品種分子鑒定技術(shù)。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0004] 發(fā)明目的：針對現(xiàn)有技術(shù)中存在的不足，本發(fā)明的目的是提供一種銀杏品種分子 檢測引物組合物，克服以往銀杏果用品種鑒定方法存在的缺陷，提供結(jié)果高度準(zhǔn)確可靠、易 于操作、靈敏度高的分子檢測和診斷方法。本發(fā)明的另一目的是提供一種使用銀杏品種分 子檢測引物組合物快速檢測銀杏品種方法，該方法可以直接應(yīng)用于生產(chǎn)實踐，對于銀杏果 用苗木的鑒定具有十分重要的意義。
[0005] 技術(shù)方案，為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明所采用的技術(shù)方案如下：
[0006] 一種銀杏品種分子檢測引物組合物，包括8對引物，其引物序列如下表所示：
[0007]
[0011]。
[0012] 使用所述銀杏品種分子檢測引物組合物快速鑒定銀杏品種的方法，包括以下步 驟：
[0013] 1)待測樣品DNA提取；
[0014] 2)PCR擴增；使用相同的反應(yīng)體系和反應(yīng)程序，按權(quán)利要求1表格中的引物順序依 次對銀杏的樣本進(jìn)行PCR擴增，直至完成鑒定；
[0015] 10y1反應(yīng)體系中包括：10Xbuffer1 ;0? 2mmol/l dNTP ;2. 5mmol/l MgC12 ; 0? 2ymol/1 SSR引物；IUTaq DNA聚合酶和40ng DNA模版。
[0016]PCR反應(yīng)程序為：預(yù)變性94°C5min;30循環(huán)的94°C30s，最佳Tm55°C30s， 72°C40s;延伸 72°Clm，最終 10°C保存；
[0017] 3)對PCR產(chǎn)物用8%聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行電泳，然后采用銀染方法對PCR擴增產(chǎn) 物進(jìn)行檢測，根據(jù)擴增產(chǎn)物的有無和擴增產(chǎn)物大小來判定結(jié)果。
[0018] 有益效果：與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下的技術(shù)優(yōu)勢：
[0019] 1)結(jié)果高度準(zhǔn)確、可靠：本發(fā)明所用銀杏果用材料來自江蘇、山東、廣西、浙江等 銀杏主要分布區(qū)，品種涵蓋面較廣，并利用本發(fā)明進(jìn)行檢測與鑒定，檢測結(jié)果100%準(zhǔn)確，為 檢測結(jié)果提供了高度的可靠性。
[0020] 2)操作簡便快速：本實驗方法對樣本進(jìn)行簡單處理、PCR擴增和常規(guī)的聚丙烯酰 胺凝膠電泳后即可以判斷結(jié)果。一般整個檢測過程可在6個小時內(nèi)完成。
[0021] 3)檢測結(jié)果靈敏度高：對待檢測樣品僅需提供模板DNA40ng即可準(zhǔn)確鑒定其所 屬種。
[0022] 4)取材方便、經(jīng)濟效益明顯：本方法實驗采樣方便，葉片、冬芽、花等組織或器官 均可為實驗材料，苗期、幼林期、成年大樹均可取樣，不受季節(jié)、地點限制。通過對銀杏苗木 進(jìn)行分子鑒定可以避免苗木生產(chǎn)與銷售過程中出現(xiàn)魚龍混雜的現(xiàn)象，對于銀杏不同品種的 苗木生產(chǎn)與銷售具有十分重要的經(jīng)濟效益。
【附圖說明】
[0023] 圖1為引物Gb_gSSR 150對48個銀杏果用品種的基因組DNA樣本的PCR擴增電 泳圖。
[0024]圖2為本發(fā)明中的8對SSR引物利用相同模板進(jìn)行擴增所得產(chǎn)物的聚丙烯酰氨凝 膠電泳圖。
【具體實施方式】
[0025] 下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明做進(jìn)一步的說明。
[0026] 實施例1
[0027] 采用454GSFLX高通量測序儀，分別對銀杏的雌株花芽和幼葉的RNA及銀杏DNA進(jìn) 行測序得到銀杏EST和基因組序列，利用MISA軟件對所得序列進(jìn)行SSR位點的尋找，利用 Primer5. 0軟件進(jìn)行引物設(shè)計。最后成功設(shè)計556對EST-SSR引物，有417對引物能夠穩(wěn) 定擴增；設(shè)計432對基因組SSR引物，隨機合成200對引物，有132對可以穩(wěn)定擴增。從銀杏 果用品種材料中隨機選取6個個體對可穩(wěn)定擴增的549對SSR引物（417對EST-SSR引物和 132對基因組SSR引物）進(jìn)行多態(tài)性檢測，最后獲得了 176對EST-SSR和82對基因組SSR多 態(tài)引物；隨后，從中選取多態(tài)性表現(xiàn)良好，且條帶清晰的40對SSR引物，包括30對EST-SSR 和10對基因組SSR引物，對48個銀杏果用品種無性系進(jìn)行PCR擴增。應(yīng)用P0PGENE進(jìn)行 相關(guān)遺傳參數(shù)計算，依據(jù)PIC值（多態(tài)性信息含量）、Shannon多樣性指數(shù)以及na*值，最終 選擇8對多態(tài)性好、重復(fù)性高的引物進(jìn)行排列組合，構(gòu)建指紋代碼。該8對SSR引物即為本 發(fā)明的銀杏品種分子檢測引物組合物，其引物序列及最佳退火溫度如表1所示。
[0028] 表1銀杏品種分子檢測引物
[0029]
[0030] 實施例2
[0031] 應(yīng)用實施例1的銀杏品種分子檢測引物組合物構(gòu)建銀杏品種