與晉南牛生長性狀相關的snp標記及其應用
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明設及基因工程及分子生物學領域，具體地說，設及一種與晉南牛生長性狀 相關的SNP標記及其應用。
【背景技術】
[0002] 晉南牛是我國四大地方良種黃牛之一，是我國珍貴的畜種資源，在我國物種基因 庫中占有重要位置。晉南牛不僅具有良好的役用性能，還具有良好的肉用性能。其育肥期 日增重居四大黃牛之首，飼料報酬和產(chǎn)肉性能均接近世界優(yōu)良肉牛品種。在肉質(zhì)上，晉南牛 強度育肥后肉質(zhì)鮮嫩，色澤鮮紅，禍體脂肪潔白，肌纖維束間脂肪沉積明顯呈大理石狀，符 合高檔牛肉標準。
[0003] 分子育種，即分子標記輔助選擇育種，是指利用DNA分子標記對育種材料進行選 擇，從而綜合改良畜禽重要經(jīng)濟性狀。單核巧酸多態(tài)性（SN巧是一類廣泛存在于畜禽基因 組上的分子遺傳標記，已廣泛應用于畜禽遺傳育種。SNP的檢測方法有多種，其中Snapshot 測序技術主要針對中等通量的SNP分型項目，其主要原理是將測序酶、四種巧光標記的 ddNTP、緊鄰多態(tài)位點的延伸引物和PCR產(chǎn)物模板按一定體系混合，引物延伸一個堿基即終 止，經(jīng)測序儀檢測，根據(jù)峰的顏色可W得知參與反應的堿基種類，從而判斷樣本在該位點的 基因型。該方法具有分型準確，通量高，不受SNP位點多態(tài)性特性限制和樣本個數(shù)限制等優(yōu) 點，非常適用于分子育種中的SNP檢測。
[0004] Gli3基因是Gli-Kruppel基因家族的成員之一。與家族中的其他基因一樣，Gli3 也有5個保守的串聯(lián)鋒指結構，鋒指間結構由組氨酸-半脫氨酸連接，該基因在動物的生長 發(fā)育過程中具有重要的調(diào)節(jié)作用。Gli3基因編碼的蛋白是一種DNA結合轉(zhuǎn)錄因子，能夠調(diào) 控關閉Sonichedgehog信號傳導通路，研究表明Gli3基因表達產(chǎn)物經(jīng)過裂解可產(chǎn)生抑制 因子阻止Sonichedgehog祀基因表達，而Sonichedgehog又可W抑制Gli3裂解，兩者間 相互制約W保證正常形態(tài)的形成?，F(xiàn)有研究表明Gli3基因?qū)χw的發(fā)育具有抑制作用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的是提供一種與晉南牛生長性狀相關的SNP標記及其應用。
[0006] 本發(fā)明的另一目的是提供用于檢測所述與晉南牛生長性狀相關的SNP標記的引 物對及含有該引物對的檢測試劑盒。
[0007] 為了實現(xiàn)本發(fā)明目的，本發(fā)明的一種與晉南牛生長性狀相關的SNP標記，其位于 晉南牛化13基因如SEQIDNO. 1所示序列的92bp處，此處堿基為C的晉南牛的生長性能 顯著優(yōu)于此處堿基為T的晉南牛。
[0008] 本發(fā)明還提供用于檢測上述與晉南牛生長性狀相關的SNP標記的引物對，包括正
[0009] 本發(fā)明還提供含有上述引物對的檢測試劑盒。所述試劑盒還包括用于Snapshot 檢測的延伸引物 5' -TCATTCCCTCTGCTGCCACCGC-3'。
[0010] 優(yōu)選地，所述試劑盒還包括dNTPs、TaqDM聚合酶、Mg2\PCR反應緩沖液、測序酶、 核酸外切酶、熱敏堿性憐酸酶、四種巧光標記ddNTP、標準陽性模板等中的至少一種。
[0011] 本發(fā)明還提供所述與晉南牛生長性狀相關的SNP標記在鑒定生長性能優(yōu)的晉南 牛優(yōu)勢品種中的應用。所述應用包括W下步驟：1)提取待測晉南牛的基因組DNA;2)W待 巧惜南牛的基因組DNA為模板，利用所述引物F和R，通過PCR反應擴增出晉南?；痠3基因 162bp片段；3)檢測PCR擴增產(chǎn)物，如果擴增產(chǎn)物序列中92bp處的堿基為C，則待測晉南牛 屬于生長性狀優(yōu)的優(yōu)勢品種。 陽01引其中，PCR反應使用的擴增體系W25yl計為：100ng/yl模板DNAliiiaOpmol/ 引物F和R各lyl，PremixTaqTM12. 5^1，（1地2〇 9. 5yl。 陽01引 PCR反應條件為：95°C10分鐘；94°C30秒，60°C30秒，72°C30秒，35個循環(huán)； 72°C10 分鐘。
[0014] 本發(fā)明進一步提供所述與晉南牛生長性狀相關的SNP標記在晉南牛分子標記輔 助育種中的應用。所述應用包括W下步驟：
[0015] (1)提取待測晉南牛的基因組DNA;
[0016] (2)通過Snapshot方法檢測待測晉南牛的基因型；
[0017] (3)根據(jù)基因型進行生長性能優(yōu)的晉南牛優(yōu)勢品種的選育。 陽0化]其中，Snapshot方法中使用的PCR引物對：包括正向引物F5'-GAGTCAGCCCAGCAGAATACTA-3'和反向引物R5'-GGCTACAGAAGACAGCCCTGC-3'。
[0019] Snapshot方法中使用的延伸引物為：5' -TCATTCCCTCTGCTGCCACCGC-3'。
[0020] 本發(fā)明對晉南牛的Gli3基因的SNP位點進行基因分型，并對該基因的C92T與晉 南牛的生長性狀進行關聯(lián)分析，通過SAS9. 2軟件GLM程序?qū)⒒蚍中徒Y果與晉南牛的生長 性狀進行關聯(lián)分析，結果發(fā)現(xiàn)CC型個體的體重和體斜長極顯著高于TT型個體（P<0. 01)， CC型個體的胸圍顯著高于TT型個體（P<0. 05)，CT型個體的體重顯著高于TT型個體 (P<0. 05)。該位點的發(fā)現(xiàn)為晉南牛生長性狀的標記輔助選擇提供了科學依據(jù)。
[0021] 通過對晉南牛Gli3基因進行單核巧酸多態(tài)性分析，將與生長性狀相關的SNP作為 分子標記，為晉南牛生長性狀的標記輔助選擇提供了科學依據(jù)。
[0022] 本發(fā)明具有如下優(yōu)點：
[0023] (一）本發(fā)明提供的分子遺傳標記不受晉南牛的年齡、性別等限制，可用于晉南牛 的早期選育，甚至在剛出生時就可準確地進行篩選，可顯著促進晉南牛的育種進程。
[0024] (二）檢測晉南牛Gli3基因單核巧酸多態(tài)性的方法準確可靠，操作簡便。
[00對 （S)晉南牛的Gli3基因的SNP位點的檢出，為晉南牛生長性狀的分子標記輔助 選擇提供了科學依據(jù)。
【附圖說明】
[0026] 圖1為本發(fā)明實施例1中晉南牛S種基因型測序圖。
[0027] 圖2為本發(fā)明實施例1中晉南牛S種基因型Snapshot測序分型圖。
【具體實施方式】
[0028]W下實施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。若未特別指明， 實施例均按照常規(guī)實驗條件，如Sambrook等分子克隆實驗手冊（SambrookJ&Russell DW,Molecularcloning:a1油oratorymanual, 2001)，或按照制造廠商說明書建議的條件。
[0029] 實施例1與晉南牛生長性狀相關的SNP標記的獲得
[0030] 1. 1待測晉南牛血液基因組DNA的提取
[0031] 尾靜脈采集待測晉南牛血液，采血管中含有抗凝劑，抗凝血樣冷凍保存運送至實 驗室。
[0032] 利用BioTeke全血基因組DNA提取試劑盒從抗凝血樣品中提取基因組DNA，具體步 驟如下：
[0033] (1)在1. 5ml離屯、管中，加900y1紅細胞裂解液，將抗凝全血恢復到室溫并顛倒混 勻，吸取300y1全血到離屯、管中，室溫放置lOmin，期間多次顛倒混勻；
[0034] (2) 1200化pm離屯、Imin，倒棄紅色上清（上清主要是血清，紅細胞碎片等雜質(zhì)，管 底殘留的為白色細胞團為白細胞）；
[0035] (3)再加300y1紅細胞裂解液重懸細胞團，重新裂解殘留的紅細胞碎片后，重復 W上步驟（1)和（2)，徹底清除紅細胞碎片，否則會影響后續(xù)DNA質(zhì)量；
[0036] (4)縱滿振蕩直到管底白細胞團重懸，分散；
[0037] 妨加300y1細胞核裂解液重懸白細胞團，在55°C溫育30-60min，直到白細胞裂 解完全，此步驟至關重要，將影響后續(xù)DNA產(chǎn)量；
[00測 （6)加100y1蛋白沉淀液，縱滿振蕩混勻；
[0039] (7) 1300化pm離屯、5min，管底出現(xiàn)暗褐色蛋白沉淀；小屯、取上清約350y1到新的 1. 5ml離屯、管；
[0040] (8)加300y1異丙醇輕柔顛倒混勻，會出現(xiàn)大團絮狀或絲狀DNA;12000巧m離屯、 Imin，管底可見白色DNA沉淀，倒棄上清；
[0041] (9)加500y1 70%乙醇，顛倒多次漂洗DNA，12000巧m離屯、Imin，小屯、倒掉上清， 然后倒置在吸水紙上輕叩幾下W控干殘留乙醇，槍頭吸盡管底和管壁殘留乙醇，空氣中驚 干靜置lOmin;
[0042] (10)加50-100y1DM溶解液燈6緩沖液），輕彈管壁均勻，室溫或4°C放置一周 重新水化DNA，期間輕彈管壁，幫助充分水化DNA;DNA可存放在2-8°C，如需要長期保存，需 放在-20°C冰箱。
[0043]1. 2擴增含SNP位點的核巧酸片段
[0044] 根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫公布的Gli3基因序列（Gene10:785371)設計引物，包括正向引 物F5，-GAGTCAGCCCAGCAGAATACTA-3,和反向引物貼' -GGCTACAGAAGACAGCCCTGC-3'。W1. 1 中的基因組DNA為模板，擴增出待測SNP所在的核巧酸片段，如SEQIDNO. 1所示。該SNP 位點位于PCR擴增片段的92bp處，此處堿基可W為C或T。 W45]PCR反應使用的擴增體系W25y1計為：lOOng/y1模板DNA1y1，lOpmol/y1引 物F和R各 1y1，PremixTaq? 12. 5y1，dd&O9. 5y1。
[0046]PCR反應條件為：95°C10 分鐘；94°C30 秒，60°C30 秒，72°C30 秒，35 個循環(huán)； 72°C10 分鐘。
[0047] 1.3檢測PCR擴增片段，獲得SNP標記
[0048] 對1. 2中的P