涂，100% 酒精 2X2min 一 95% 酒精 lX5min 一 70% 酒精 lX5min 一 50%酒精lX5min一DEPC水洗涂2X3min一DEPC-PBS洗涂2X5min。
[0108] 4)滴加300μ1胃蛋白酶K(10μg/ml)于切片上，37°C消化20min。
[0109] 5)切片入PBS(0.1M PBS+2mg/ml谷氨酸)洗涂Imin，中止反應。
[0110] 6)切片入0.2N肥L，于37°C反應20-30min，增加組織的通透性。
[0111] 7)切片用4%多聚甲醒(0.1M PBS溶解)后固定lOmin，室溫。
[0112] 8)為了增加組織陽性雜交強度，對切片進行乙酷處理。切片入0.25%乙酸酢 Buffed(0.1MS 乙醇胺），室溫 lOmin。
[011 引 9)11 PBS 洗涂 2X5min。
[0114] 預雜交和雜交
[0115] 預雜交:-20°C保存的預雜交液，先置于37°C解育60min，預雜交液的用量為50μ1， 石蠟膜履蓋切片，37°C濕盒中預雜交2小時。（預雜交液成份包括：2XSSC，10%Dextran sul曲ate,IX Denhar化'S solution，50mM Phosphate Buffe;r(PH 7.0)，50mM 0ΤΤ，250μ1， lOOμg/ml poly A,扣g/ml poly dA，250μg/ml yeast t-RNA，500μg/ml ssDNA，47% Deionized formamide)。
[0116] 1)移去石蠟膜，甩掉預雜交液，切片置于2 X SSC中5min。
[0117] 2)雜交反應：37°C雜交過夜（18-20h)。每一切片加入25化1雜交液并用石蠟膜履 蓋。預雜交液中加入相應的探針就成為雜交液。雜交液在預雜交時配制，放置37°C解育，使 探針充分溶解于雜交液中，本實驗用多條寡核巧酸探針混合，按每一探針500ng/ml濃度配 制成探針雜交液。地高辛加尾標記試劑盒標記探針濃度計算依據(jù):每一探針的濃度按其與 陽性定量探針時檢測反應時顯色進行比對和10化mol 30個堿基的裸探針標記反應理論探 針產(chǎn)量為90化g兩種標準進行綜合計算出標記探針的濃度。
[0118] 3)雜交后洗涂，切片浸入2 X SSC，lOmin，掲去石蠟膜。依次于搖床上搖動洗涂，2 X SSC(0.5%SDS)，2X15min^0.25XSSC(0.5%SDS)，2X15min。
[0119] 雜交后顯色檢測反應
[0120] 1)采用Anti-Digoxigenin-POD檢測地高辛探針與mRNA結(jié)合復合物;TSA放大系統(tǒng) 增
[0121] 強原位雜交反應顯色反應的陽性信號，DAB顯色。
[0122] 2)切片轉(zhuǎn)至TNT緩沖液中，3X5min。
[0123] 3)滴加 TNB 阻斷緩沖液，300yl/TMAs，室溫，30min。
[0124] 4)吸去多余阻斷劑，l:100稀釋的Anti-Digoxigenin-P0D(TBS+0.1%TritonX-100+1 %阻斷劑），室溫4小時。
[0125] 5)TNT BuffeHO.lM Tris-CL，pH7.5,0.151 NaCL，0.05%Tween 20)洗涂， 3x5min〇
[0126] 6)切片上滴加信號放大試劑8;[0古;!_町1了731111(1，30041/了1六3，（8;!_0^町117則111王(1 膽存液：Biotinyl Tyramid溶解于0.2ml DMSO,Biotinyl Tyramid工作液：1 X稀釋液，1:50 稀釋Biotinyl Tyramid膽存液），室溫10分鐘。
[0127] 7)TNT 洗，3X5min。
[0128] 8)切片滴加 SA-HRP(鏈霉卵白素-辣根過氧化物酶），300wl/TMAs，室溫30min。
[0129] 9)TNT洗，3X5min。
[0130] 10)蒸溜水洗涂，IXlmin。
[0131] 11)DAB顯色，顯微鏡下控制顯色反應。
[0132] 12)蘇木素復染，
[0133] 13)酒精梯級脫水，切片干燥。
[0134] 14)滴加封片膠，相應規(guī)格的蓋玻片蓋片，紫外燈下交聯(lián)切片Imin。
[013引1.7結(jié)果判斷及標準
[0136] 應用光學顯微鏡分別在低倍和高倍鏡下進行觀察，首先觀察目標RNA的陽性表達 信號在觀察目標細胞內(nèi)的定位:位于細胞核、細胞漿或細胞膜。
[0137] 再分別W該檢測RNA表達部位陽性信號的強度和陽性表達的細胞數(shù)兩種標準進行 綜合評分，判斷標準為：（1)依據(jù)陽性細胞染色強度判斷:a.細胞無染色，記0分;b.細胞染成 淺棟色為弱陽性，記1分;C.細胞染成棟色且無背景著色，或細胞染成深棟色并有淺棟色背 景為中等陽性，記2分;d.細胞染成深棟色且無背景著色為強陽性，記3分。（2)依據(jù)陽性細胞 表達數(shù)計分:a.無陽性細胞表達，記0分;b.陽性表達細胞數(shù)含25%，記1分;C. 25% <陽性細 胞數(shù)<50%，記2分;d.陽性表達細胞數(shù)含50%，記3分。
[0138] 為了盡量降低評分結(jié)果的主觀因素，由兩位病理學專家分別按上述標準之一各自 進行判斷和評分，再將兩者評分相乘，結(jié)果為:①0分者最終計為0分，認為陰性表達;②1分 和2分者最終計為1分，認為弱陽性表達;③3分和4分者最終計為2分，認為中等陽性表達;④ 6分到9分者最終計為3分，認為強陽性表達。
[0139] 1.8分析和統(tǒng)計軟件
[0140] 應用SPSS13.0統(tǒng)計軟件對實驗結(jié)果進行統(tǒng)計學分析，兩兩比較用^test或Fisher exact test，相關(guān)性分析采用Spearmen correlation方法;P<0.05即差異有統(tǒng)計學意義。 生存曲線分析采用Kaplan-Meier method及l(fā)og-rank test;多變量分析采用Cox's proportional hazards model ;P<0.05即差異有統(tǒng)計學意義。
[0141] 2 結(jié)果
[0142] 2.1 L0C284454在鼻咽癌中的表達比正常對照組織中的表達顯著升高
[0143] L0C284454在79.5%的鼻咽癌組織中（79/112例)有表達，而僅在17.6% (34例慢性 炎癥上皮組織樣本中的6例）的正常鼻咽上皮組織中有表達（圖3)，兩者之間具有明顯的統(tǒng) 計學差異(P<〇.〇〇l)。
[0144] 2.2 L0C284454高表達的鼻咽癌患者預后較差
[0145] 我們對112例鼻咽癌患者進行了電話隨訪，詳細詢問了他們的首發(fā)時間、治療情 況、有無復發(fā)、有無再患其他疾病、復發(fā)及死亡時間等，并登記了生存時間和狀態(tài)，并對鼻咽 癌組織中L0C284454的表達與病人的生存時間和狀態(tài)進行的生存分析，發(fā)現(xiàn)L0C284454高表 達患者平均生存時間明顯短于L0C284454低表達或不表達的患者（圖4)。說明L0C284454是 一個與鼻咽癌預后相關(guān)的分子標記，該IncRNA表達高，病人預后差。
[0146] 實施例4,構(gòu)建shRNA載體干擾L0C284454的表達
[0147] 1.材料方法
[014引1.1試劑及試劑盒
[0149] 限制性內(nèi)切酶Hind III、Bgl II、EcoR I及Cla I，T4DNA連接酶等購自TakaRa公 司；
[0150] TRIZOL? Reagent(Invitrogen)；
[0151] 質(zhì)粒抽提試劑盒(邸6943-01，0MEGA);
[0152] 膠回收試劑盒(觀5212,0MEGA);
[0153] 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（#A3500，Promega);
[0154] 抗生素 G418(Ameresc)。
[015引 1.2 shRNA的設計
[0156] 首先將L0C284454序列輸入Invitrogen公司的Block-It RNAi desi即er軟件，尋 找該IncRNA的shRNA最佳祀點，挑選最佳的3條相應的祀點序列如下：
[0157] shRNA-1 :GACTCAGAATCAGACCTGTGT如沈Q NO: 16所示，
[0158] shRNA-2 :GCATAGATAGGTGGGTGAGTG如沈Q NO: 17所示，
[0159] shRNA-3:GACACAAGCAGGTGTGCTTAG如沈Q NO: 18所示，
[0160] W廣泛使用的在人類基因組中沒有任何祀點的Scramble序列作為陰性對照，其序 列如下：
[0161] Scramble:5'-GACACGCGACTTGTACCAC-3'如沈QN0:19所示。
[0162] 針對運3條IncRNA祀點序列，及Scramble序列，根據(jù)Oligo化gine公司pSUPER載體 說明書，設計可形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)的寡核巧酸單鏈及其反向互補序列，它們退火后即可形成兩 端分別帶限制性酶切位點Bglll和化ndlll粘性末端的DNA雙鏈。具體需合成的各條寡核巧 酸序列及它們配對退火后形成的DNA雙鏈如下：
[0163] shRNA-1：
[0164] 5'-GATCCCC GACTCAGAATCAGACCTGTGT TTCAAGAGA ACACAGGTCTGATTCTGAGTC TTTTTA-3'
[0165] 3'-GGG CTGAGTCTTAGTCTGGACACA AAGTTCTCT TGTGTCCAGACTAAGACTCAG AAAAATTCGA-5，
[0166] 如沈Q N0:20、21 所示，
[0167] shRNA-2：
[0168] 5'-GATCCCC GCATAGATAGGTGGGTGAGTG TTCAAGAGA CACTCACCCACCTATCTATGC TTTTTA-3'
[0169] 3'-GGG CGTATCTATCCACCCACTCAC AAGTTCTCT GTGAGTGGGTGGATAGATACG AAAAATTCGA-5，
[0170] 如沈Q NO:22、23所示，
[0171] shRNA-3：
[0172] 5'-GATCCCC GACACAAGCAGGTGTGCTTAG TTCAAGAGA CTAAGCACACCTGCTTGTGTC TTTTTA-3'
[0173] 3'-GGG CTGTGTTCGTCCACACGAATC AAGTTCTCT GATTCGTGTGGACGAACACAG AAAAATTCGA-5'。
[0174] 如沈Q NO:24、25所示，
[0175] Scramble
[0176] 5'-GATCCCC GACACGCGACTTGTACCAC TTCAAGAGA GTGGTACAAGTCGCGTGTC TTTTTA- 3，
[0177] 3'-GGG CTGTGCGCTGAACATGGTG AAGTTCTCT CACCATGTTCAGCGCACAG AAAAATTCGA-5，
[017引如沈Q NO:26、27所示。
[0179] 兩條互補配對的DNA退火后，左邊是限制性內(nèi)切酶Bgl II的粘性末端，右邊是化nd III的粘性末端。
[0180] 1.3 shRNA載體構(gòu)建
[0181] 化學合成上述4個shRNA對應的8條單鏈oligo序列，將合成好的oligo用oligo annealing buffer溶解成20μΜ，互補單鏈各取10μ1混合。然后將oligo混合物在PCR儀中95 °C加熱5分鐘，然后自然冷卻至室溫，形成雙鏈oligo片段。
[0182] 用Bgl Π 和化nd III雙酶切pSUP邸質(zhì)粒，回收3.化b的載體片段，將退火后的粘性 末端的DNA和酶切回收的載體按照3:1的物質(zhì)量的比例混合，用T4連接酶，16°C連接過夜。轉(zhuǎn) 化E.coil感受態(tài)，挑選轉(zhuǎn)化子，菌落PCRW及測序鑒定，再