表達(dá)紅色熒光蛋白的重組沙門氏菌及其構(gòu)建方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及基因工程領(lǐng)域，具體地說，設(shè)及一種表達(dá)紅色巧光蛋白的重組沙口氏 菌及其構(gòu)建方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 沙口氏菌屬（Salmonella)是沙口氏菌病的病原體。屬于腸桿菌科，革蘭氏陰性腸 道桿菌。已發(fā)現(xiàn)的近千種沙口氏菌菌株，按其抗原成分，可分為甲、乙、丙、下、戊等基本菌 組。其中與人體疾病有關(guān)的主要有甲組的副傷寒甲桿菌，乙組的副傷寒乙桿菌和鼠傷寒桿 菌，丙組的副傷寒丙桿菌和豬霍亂桿菌，下組的傷寒桿菌和腸炎桿菌等。除傷寒桿菌、副傷 寒甲桿菌和副傷寒乙桿菌引起人類的疾病外，大多數(shù)僅能目引起家畜、鼠類和禽類等動(dòng)物 的疾病，但有時(shí)也可污染人類的食物而引起食物中毒。
[0003] 沙口氏菌是一種常見的食源性致病菌。沙口氏菌最適繁殖溫度為37°C，在20°C W 上即能大量繁殖，因此，低溫儲(chǔ)存食品是一項(xiàng)重要的預(yù)防措施。
[0004] 構(gòu)建能夠表達(dá)巧光蛋白的重組沙口氏菌，可為臨床分離的沙口氏菌的深入研究提 供有效手段。國內(nèi)已有表達(dá)綠色巧光蛋白的減毒鼠傷寒沙口氏菌的構(gòu)建方法(王芳，江蘇農(nóng) 業(yè)研究，2001,22(3):55-58.),該方法需將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入沙口氏菌中間宿主后進(jìn)行陽性 克隆篩選，再從陽性菌體中提取出質(zhì)粒，最終轉(zhuǎn)化入沙口氏菌終末宿主。該方法需要中間宿 主的參與，過于繁瑣，且綠色巧光標(biāo)記較為常見，如果試驗(yàn)中需要與其他目的蛋白進(jìn)行共定 位，則二抗就不能再使用常見的FITC進(jìn)行巧光標(biāo)記。因此，有必要開發(fā)一種新型的能夠表達(dá) 巧光蛋白的重組沙口氏菌。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的是提供一種表達(dá)紅色巧光蛋白的重組沙口氏菌及其構(gòu)建方法。
[0006] 為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明目的，本發(fā)明提供的表達(dá)紅色巧光蛋白的重組沙口氏菌，所述重 組沙口氏菌是用質(zhì)粒pFPV-m化er巧轉(zhuǎn)化沙口氏菌獲得的陽性克隆。
[0007] 本發(fā)明還提供所述重組沙口氏菌的構(gòu)建方法，將質(zhì)粒pFPV-m化erry通過電擊轉(zhuǎn)化 的方式進(jìn)入沙口氏菌體內(nèi)，并篩選陽性克隆。
[0008] 本發(fā)明所述的沙口氏菌包括但不限于德爾卑沙口氏菌、嬰兒沙口氏菌。
[0009] 前述的方法，優(yōu)選用抗生素---氨節(jié)青霉素篩選陽性克隆。
[0010] 前述的方法具體包括W下步驟：
[0011 ] 步驟1:質(zhì)粒pFPV-mCherry的提??；
[0012] 步驟2:沙口氏菌感受態(tài)細(xì)胞的制備；
[0013] 步驟3:電擊轉(zhuǎn)化；
[0014] 步驟4:陽性克隆的篩選；
[0015] 步驟5:重組菌的形態(tài)學(xué)的鑒定、生長(zhǎng)曲線測(cè)定、遺傳穩(wěn)定性分析及毒力因子檢測(cè)。 [0016]步驟1具體為：用質(zhì)粒提取試劑盒提取質(zhì)粒pFPV-m化erry，提取后測(cè)定質(zhì)粒濃度， 使質(zhì)粒濃度達(dá)到5pg-化ng/化。例如，使用OMEGA公司的E.Z.N.A瓜Plasmid Mini Kit II試 劑盒提取質(zhì)粒，提取后使用NanoDrop⑥ND-2000C測(cè)定濃度，調(diào)整合適濃度，使轉(zhuǎn)化時(shí)用量 為1 -化L，質(zhì)粒DNA含量為10pg-25ng。
[0017] 步驟2具體為：
[0018] (1)使用LB培養(yǎng)液于37 °C 20化pm的搖床振蕩培養(yǎng)沙口氏菌，測(cè)量培養(yǎng)液ODs日日值，待 ODsoq值在0.35-0.45之間時(shí)，迅速將菌液冰浴15-30min，不時(shí)緩慢搖勻W保證菌液充分冷 卻；
[0019] (2)4°CW4000g離屯、lOmin，回收細(xì)胞;然后用冰冷的純水重懸細(xì)胞后再次離屯、洗 涂，將其中的電解質(zhì)雜質(zhì)洗掉，并逐步用10%甘油重懸、洗涂;最后Wlml冰冷的10%甘油重 懸沉淀；
[0020] (3)稀釋上述懸液后測(cè)量ODsoo值，用冰冷的10%甘油將其稀釋至濃度為2 X l〇w~3 X l〇w個(gè)細(xì)胞/ml (ODsgg值1.0，約2.5 X 10"個(gè)細(xì)胞/ml)，準(zhǔn)備電擊轉(zhuǎn)化。
[0021] 或者，凍存在-80°C，將感受態(tài)細(xì)胞懸液按50化/份分裝到冷卻的無菌0.5ml微量離 屯、管中，封緊管口，沒入液氮中快速冰凍。膽存于-80°C備用。需要用凍存的感受態(tài)細(xì)胞做電 擊轉(zhuǎn)化時(shí)，從-80°C冰箱中取出適當(dāng)?shù)姆輸?shù)，待其融化后按照電擊轉(zhuǎn)化的操作進(jìn)行。
[0022] 步驟3具體為：
[0023] (1)用移液器吸取50化新鮮制備或凍融的沙口氏菌感受態(tài)細(xì)胞于0.5ml冰冷的微 量無菌離屯、管中，與電轉(zhuǎn)化儀樣品池一起放在冰上冷卻；
[0024] (2) Wl-化L的體積向每個(gè)離屯、管中加入10pg-25ng的待轉(zhuǎn)化質(zhì)粒DNA，置于冰上 3〇-60s;
[0025] (3)調(diào)節(jié)電轉(zhuǎn)儀，使電脈沖為25iiF，電壓25kV，電阻200 Q ;將感受態(tài)細(xì)胞與質(zhì)粒DNA 的混液加至冰冷的電擊杯內(nèi)，將電擊杯放進(jìn)電轉(zhuǎn)儀中，按上述設(shè)定的參數(shù)，啟動(dòng)對(duì)細(xì)胞的電 脈沖;儀器應(yīng)顯示出4-5ms具有12.5kV/cm的電場(chǎng)強(qiáng)度；
[00%] (4)脈沖結(jié)束后，迅速取出樣品池，室溫下加入1ml LB肉湯培養(yǎng)基，37°C16化pm振 蕩培養(yǎng)化W復(fù)蘇細(xì)菌；
[0027] (5)取不同體積的電擊轉(zhuǎn)化后的細(xì)菌，鋪于含有氨節(jié)青霉素的LB瓊脂培養(yǎng)基;室溫 下待培養(yǎng)基中的液體被完全吸收，倒置瓊脂培養(yǎng)基，于37°C培養(yǎng)箱培養(yǎng)12-1化，轉(zhuǎn)化克隆即 重組菌應(yīng)在12-1化出現(xiàn)。
[0028] 步驟4具體為：
[0029] (1)配制LB肉湯培養(yǎng)基或LB瓊脂培養(yǎng)基，高壓滅菌后待其溫度降至50°C-55°C時(shí) (瓊脂培養(yǎng)基溫度不能太低，否則會(huì)凝固，故可使用恒溫水浴鍋W保證溫度），加入適量氨節(jié) 青霉素使其終濃度為10化g/ni;
[0030] (2)使用含有氨節(jié)青霉素的LB液體或固體培養(yǎng)基培養(yǎng)的細(xì)菌，則為具有氨節(jié)青霉 素抗性的陽性克隆；
[0031] (3)進(jìn)一步使用選擇性培養(yǎng)基化D/SS驗(yàn)證篩選，在化D/SS培養(yǎng)基中加入氨節(jié)青霉 素培養(yǎng)的細(xì)菌為陽性克隆;或者將培養(yǎng)后的菌涂于載玻片上，在巧光倒置顯微鏡下觀察，若 能看到相應(yīng)的巧光，則為陽性克隆。
[0032] 步驟5中所述形態(tài)學(xué)的鑒定具體為：
[0033] (1)將凍存的轉(zhuǎn)化成功的重組菌在含有氨節(jié)青霉素的LB肉湯培養(yǎng)基中活化、傳代 3-4代。同時(shí)在普通LB培養(yǎng)基中傳代培養(yǎng)受體沙口氏菌(即原始沙口氏菌）。
[0034] (2)將傳代后的菌W合適的濃度均勻涂布于含有氨節(jié)青霉素的LB瓊脂培養(yǎng)基上。 同樣在普通LB瓊脂培養(yǎng)基上涂布受體沙口氏菌，37°C恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)12-2地，比較菌的形 態(tài)特征并拍照。
[0035] 步驟5中所述生長(zhǎng)曲線測(cè)定具體為：
[0036] (1)從-80°C冰箱中取出凍存的沙口氏菌按普通的方法活化，傳代3-4代，重組菌培 養(yǎng)的整個(gè)過程均應(yīng)添加氨節(jié)青霉素，下同。
[0037] (2)使用預(yù)置有300mL LB肉湯培養(yǎng)基的500血容量的S角瓶，分別加入15mL上一步 中培養(yǎng)的菌液，37 °C恒溫振蕩培養(yǎng)，200巧m。
[0038] (3)每隔化取出菌液，用分光光度計(jì)測(cè)定ODsoo值，監(jiān)測(cè)生長(zhǎng)曲線趨勢(shì)，測(cè)定到對(duì)數(shù) 末期即可。
[0039] (4)統(tǒng)計(jì)整理數(shù)據(jù)結(jié)果，并作圖。
[0040] 步驟5中所述遺傳穩(wěn)定性分析具體為：
[0041] (1)將重組菌株涂布于加有氨節(jié)青霉素的LB瓊脂平板，在37°C恒溫培養(yǎng)16h;
[0042] (2)挑取單菌落接種于含有氨節(jié)青霉素的7mL LB肉湯培養(yǎng)基中，去除不含質(zhì)粒的 陰性沙口氏菌，過夜培養(yǎng)(8-lOh)使細(xì)菌達(dá)到生長(zhǎng)對(duì)數(shù)中后期；
[0043] (3)然后取70化上述菌液接種于不含抗生素的7ml LB肉湯培養(yǎng)基中，37°C培養(yǎng) 12h，然后取出70iiL同樣接種于不含抗生素的7ml LB肉湯培養(yǎng)基中；
[0044] (4)重復(fù)(3)的操作8次(根據(jù)菌落計(jì)數(shù)方法，每培養(yǎng)1