本發(fā)明涉及一種土壤修復(fù)劑的制備方法及施用方法，尤其涉及一種石油污染土壤修復(fù)劑體系的制備方法及實(shí)施工藝。
背景技術(shù)：
石油產(chǎn)業(yè)是我國國民經(jīng)濟(jì)的支柱產(chǎn)業(yè)之一，對我國國民經(jīng)濟(jì)的發(fā)展具有重大的影響。油田開采經(jīng)歷了一次采油、二次采油和三次采油，目前普遍使用的化學(xué)三元復(fù)合驅(qū)技術(shù)，是國內(nèi)外在三次采油階段開發(fā)的一項(xiàng)高效提高采收率技術(shù)，但其對于土壤的污染極大，而且污染土壤很難再次利用。生物修復(fù)是一種較為環(huán)保的石油污染土壤進(jìn)行處理方式，現(xiàn)有生物修復(fù)技術(shù)基本以典型的耕作法、堆放法和堆肥法為主，但其存在污染修復(fù)受環(huán)境限制因素大、土壤持水效率低、原油與修復(fù)物（肥料、菌、調(diào)節(jié)劑）接觸效率低、修復(fù)周期長及修復(fù)效率不高等問題，難以得到大范圍的推廣。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明對于上述現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供了一種石油污染土壤修復(fù)劑體系的制備方法及實(shí)施工藝。
本發(fā)明的一種石油污染土壤修復(fù)劑體系，是由土壤調(diào)節(jié)液、石油烴降解菌劑、固體肥料載體、生物聚合物菌劑和營養(yǎng)液構(gòu)成，
所述的土壤調(diào)節(jié)液是由生物脂肽表面活性劑10～20份、腐殖酸溶液1～10份、雙氧水0.1～0.5份、水60～90份，混合均勻制得；
所述的石油烴降解菌劑是由1～5份的石油烴降解菌發(fā)酵原液與15～20份營養(yǎng)液，混合均勻制得；
所述的固體肥料載體是將秸稈、樹葉和廢棄果蔬殘余中的一種或者幾種的混合物粉碎為1～3mm顆粒，再與有機(jī)糞按質(zhì)量比10:0.5的配比混合，然后用質(zhì)量濃度為0.05%腐殖酸溶液浸潤，常溫25℃下，控制濕度30～50%，堆肥發(fā)酵2個月后，與增氧劑按10：0.1混合均勻，即得固體肥料載體；
所述的生物聚合物菌劑是由1～5份的生物聚合物菌發(fā)酵原液與15～20份營養(yǎng)液，混合均勻制得；
所述的營養(yǎng)液是由糖蜜0.1～1份、尿素0.1～1份、酵母粉0.01～0.1份、玉米漿干粉0.1～1份、磷酸氫二鉀0.1～0.5份、水96～99份，混合均勻制得；
以上均為質(zhì)量份數(shù)、質(zhì)量比和質(zhì)量百分比。
作為本發(fā)明的進(jìn)一步改進(jìn)，所述的石油烴降解菌發(fā)酵原液的制備方法如下：
a、菌種誘變：將地衣芽孢桿菌cgmcc1.7461接種過夜培養(yǎng)，制得待誘變發(fā)酵液，然后將待誘變發(fā)酵液進(jìn)行600～750微克/毫升ntg處理，按照1:1進(jìn)行混勻，25℃保溫30min，離心取下層細(xì)胞，洗滌細(xì)胞，于lb培養(yǎng)基中重懸、其細(xì)胞濃度為1.0×108～2.0×108個/ml，25℃培養(yǎng)過夜，稀釋涂板，選擇能夠在10℃～25℃溫度條件下，利用正十六烷、苯、菲和環(huán)己烷為單一碳源生長、對芳烴及環(huán)烷烴有較強(qiáng)的降解能力的菌種即為目標(biāo)菌種；
b、發(fā)酵液制備：
a、目標(biāo)菌種活化：斜面目標(biāo)菌種挑出2環(huán)至含300ml液體培養(yǎng)基的500ml搖瓶中活化培養(yǎng)，溫度25±2℃、100轉(zhuǎn)/分震蕩培養(yǎng)18～24小時，得到活化菌液；
b、制備種子液：將a步驟制得的活化菌液轉(zhuǎn)接到5l搖瓶中培養(yǎng)，5l搖瓶裝液量60%，接種量5%，溫度25±2℃、100轉(zhuǎn)/分震蕩培養(yǎng)24～30小時，得到種子菌液；
c、初級發(fā)酵培養(yǎng)：將b步驟制得的種子菌液導(dǎo)入(200l)一級種子發(fā)酵罐中，種子罐裝液量80%，接種量5%，控制通風(fēng)量0.2～0.4vvm，攪拌轉(zhuǎn)速100轉(zhuǎn)/分，ph值控制在7.0～8.0，溫度25±2℃，培養(yǎng)24～36小時后，得到一級發(fā)酵菌種；
d、發(fā)酵培養(yǎng)：將c步驟制得的以及發(fā)酵菌種導(dǎo)入（10m3）三級發(fā)酵罐，三級發(fā)酵罐按60%裝液量，接種量5%，控制通風(fēng)量0.2～0.4vvm，過程ph值控制在7.0～8.5，溫度25±2℃，攪拌速度80轉(zhuǎn)/分，培養(yǎng)30～48小時后，制得石油烴降解菌發(fā)酵原液，其中烴降解菌菌數(shù)在2×108個/m以上；
上述搖瓶及發(fā)酵罐培養(yǎng)基配方是：液態(tài)石蠟0.5～1份，氯化銨2～3份、酵母粉0.2～0.4份、磷酸二氫鉀1.5～2份、七水硫酸鎂0.2～0.5份、氯化錳0.1～0.5份、氯化鈣0.2～0.5份、裝液量控制在80%、培養(yǎng)溫度25～30℃、控制通風(fēng)量0.2～0.4vvm，攪拌速度控制在50～80rpm，以上均為質(zhì)量份數(shù)；
以上均為質(zhì)量份數(shù)、質(zhì)量比和質(zhì)量百分比。
作為本發(fā)明的進(jìn)一步改進(jìn)，所述的生物聚合物菌發(fā)酵原液的制備方法如下：
a、菌種誘變：將野油菜黃單胞菌cgmcc1.1781接種過夜培養(yǎng)，制得待誘變發(fā)酵液，然后將待誘變發(fā)酵液進(jìn)行600～750微克/毫升ntg處理，按照1:1進(jìn)行混勻，25℃保溫30min，離心取下層細(xì)胞，洗滌細(xì)胞，于lb培養(yǎng)基中重懸、其細(xì)胞濃度為1.0×108～2.0×108個/ml，25℃培養(yǎng)過夜，稀釋涂板，選擇可在20～40℃溫度下，利用糖類為碳源產(chǎn)生生物復(fù)合多糖的菌種即為目標(biāo)菌種；
b、發(fā)酵液制備：
a、目標(biāo)菌種活化：斜面目標(biāo)菌種挑出2環(huán)至含100ml液體培養(yǎng)基的500ml搖瓶中活化培養(yǎng)，溫度25±2℃、150轉(zhuǎn)/分震蕩培養(yǎng)10～15小時，得到活化菌液；
b、制備種子液：a步驟制得的活化菌液轉(zhuǎn)接到5l搖瓶中培養(yǎng)，5l搖瓶裝液量20%，接種量10%，溫度25±2℃、150轉(zhuǎn)/分震蕩培養(yǎng)10～15小時，得到種子菌液；
c、一級發(fā)酵培養(yǎng)：將b步驟制得的種子菌液導(dǎo)入(100l)一級種子發(fā)酵罐中，種子罐裝液量50%，接種量10%，控制通風(fēng)量0.5vvm，攪拌轉(zhuǎn)速130轉(zhuǎn)/分，ph值控制在7.0～8.0，溫度25±2℃，培養(yǎng)8～13小時后，得到一級發(fā)酵菌種；
d、二級發(fā)酵培養(yǎng)：將c步驟制得的一集發(fā)酵菌種導(dǎo)入二級(1m3)種子罐，二級罐裝液量50%，接種量10%，控制通風(fēng)量0.5～0.6vvm，攪拌轉(zhuǎn)速100轉(zhuǎn)/分，ph值控制在7.0～8.0，溫度25±2℃，培養(yǎng)5～8小時，制得二級發(fā)酵菌液；
e、發(fā)酵培養(yǎng)：將d步驟制得的制得二級發(fā)酵菌液導(dǎo)入（10m3）三級發(fā)酵罐，三級發(fā)酵罐按50%裝液量，接種量10%，通風(fēng)量0.7～0.8vvm，過程ph值控制在7.0～8.5，溫度25±2℃，攪拌速度80轉(zhuǎn)/分，培養(yǎng)6～8小時后，即制得生物聚合物菌發(fā)酵原液，控制微生物復(fù)合多糖在微生物發(fā)酵液中占1%～1.8%；
上述搖瓶及各級發(fā)酵罐培養(yǎng)基配方是：玉米糖漿10～20份、酵母膏5～7份、蛋白胨0.2～0.3份、磷酸二氫鉀1.5～2份、七水硫酸鎂0.3～0.5份、氯化鈣0.1～0.2份、裝液量為20～50%、培養(yǎng)溫度25±2℃、ph值7～8，攪拌速度控制在80～150rpm，以上為質(zhì)量份數(shù)；
以上均為質(zhì)量份數(shù)、質(zhì)量比和質(zhì)量百分比。
作為本發(fā)明的進(jìn)一步改進(jìn)，所述的固體肥料載體中的增氧劑是由過氧化鈣和過氧化尿素按質(zhì)量配比20：1混合而成。
作為本發(fā)明的進(jìn)一步改進(jìn)，所述的土壤調(diào)節(jié)液中的腐殖酸溶液的質(zhì)量濃度大于50%。
一種石油污染土壤修復(fù)劑體系的實(shí)施工藝，其具體操作步驟如下：先噴灑土壤調(diào)節(jié)液，每平方米噴灑1～4l；然后噴灑石油烴降解菌劑，每平方米噴灑1～4l后，鋪撒增氧劑，每平方米均勻鋪撒100～200g；再噴灑生物聚合物菌劑，每平方米噴灑1～2l后，鋪撒固體肥料載體顆粒1～2cm厚，最后再次噴灑生物聚合物菌劑，每平方米噴灑1～4l即可。
其中，生物復(fù)合驅(qū)油劑中的生物脂肽表面活性劑的制備方法為公開技術(shù)，其已被專利號為201110343413.6的發(fā)明專利《一種脂肽生物表面活性劑的工業(yè)化制備方法》所公開。
本發(fā)明的一種石油污染土壤修復(fù)劑體系的制備方法及實(shí)施工藝，適用于石油污染土壤的大規(guī)模原位生物修復(fù)，其有益效果為：
1）本發(fā)明以土壤調(diào)節(jié)劑中的生物脂肽表面活性劑作為乳化分散劑，提高石油與土壤的溶解效果，促進(jìn)石油烴微生物的生長，抑制有害微生物繁殖；
2）引入的外源石油烴降解菌，其在中低溫（5～10℃）下降解石油烴效率達(dá)到43.7%，同時，該菌在不含有石油烴的區(qū)域代謝多糖聚合物，該聚合多糖可激活本源石油烴降解菌，并且該物質(zhì)形成粘液膜層，可暫時性覆蓋石油烴降解環(huán)境，控制微環(huán)境水分與溫度蒸發(fā)，保證環(huán)境濕度與溫度，進(jìn)一步提高石油污染的降解效率；
3）本發(fā)明專利所用固體秸稈、樹葉、果蔬殘余是廢棄物的資源化利用，原料易得，工藝較簡單，為微生物生長提供適宜的的基質(zhì)，同時，載體經(jīng)粉碎發(fā)酵制成肥料對固化微生物生長，保證微環(huán)境中營養(yǎng)物質(zhì)、濕度、溫度等指標(biāo)，對提高本源土壤菌群活力、緩解板結(jié)污染土壤有重要作用；
4）土壤調(diào)節(jié)液、兩種菌劑與營養(yǎng)劑、載體肥料三體系的優(yōu)化實(shí)施工藝，5%或以下的石油污染土壤，在溫度5～10℃條件石油降解率達(dá)39%～43.7%；在15～20℃條件石油降解率達(dá)59.8%，溫度在25～30℃條件，石油降解率達(dá)87.5%以上。
具體實(shí)施方式
實(shí)施例1
本發(fā)明的一種石油污染土壤修復(fù)劑體系，是由土壤調(diào)節(jié)液、石油烴降解菌劑、固體肥料載體、生物聚合物菌劑和營養(yǎng)液構(gòu)成，
所述的土壤調(diào)節(jié)液是由生物脂肽表面活性劑10份、腐殖酸溶液1份、雙氧水0.1份、水60份，混合均勻制得，所述的土壤調(diào)節(jié)液中的腐殖酸溶液的質(zhì)量濃度大于60%；
所述的石油烴降解菌劑是由1份的石油烴降解菌發(fā)酵原液與15份營養(yǎng)液，混合均勻制得；
所述的固體肥料載體是將秸稈、樹葉和廢棄果蔬殘余中的一種或者幾種的混合物粉碎為1mm顆粒，再與有機(jī)糞按質(zhì)量比10:0.5的配比混合，然后用質(zhì)量濃度為0.05%腐殖酸溶液浸潤，常溫25℃下，控制濕度30%，堆肥發(fā)酵2個月后的發(fā)酵混合物備用，使用前將發(fā)酵后的混合物與增氧劑按10：0.1混合配比制得，所述的增氧劑是由過氧化鈣和過氧化尿素按質(zhì)量配比20：1混合而成；
所述的生物聚合物菌劑是由1份的生物聚合物菌發(fā)酵原液與15份營養(yǎng)液，混合均勻制得；
所述的營養(yǎng)液是由糖蜜0.1份、尿素0.1份、酵母粉0.01份、玉米漿干粉0.1份、磷酸氫二鉀0.1份、水96份，混合均勻制得；
以上均為質(zhì)量份數(shù)、質(zhì)量比和質(zhì)量百分比。
所述的石油烴降解菌發(fā)酵原液的制備方法如下：
a、菌種誘變：將地衣芽孢桿菌cgmcc1.7461接種過夜培養(yǎng)，制得待誘變發(fā)酵液，然后將待誘變發(fā)酵液進(jìn)行600微克/毫升ntg處理，按照1:1進(jìn)行混勻，25℃保溫30min，離心取下層細(xì)胞，洗滌細(xì)胞，于lb（luria-bertani）培養(yǎng)基中重懸、其細(xì)胞濃度為1.0×108～2.0×108個/ml，25℃培養(yǎng)過夜，稀釋涂板，選擇能夠在10℃～25℃溫度條件下，利用正十六烷、苯、菲和環(huán)己烷為單一碳源生長、對芳烴及環(huán)烷烴有較強(qiáng)的降解能力的菌種即為目標(biāo)菌種；
b、發(fā)酵液制備：
a、目標(biāo)菌種活化：斜面目標(biāo)菌種挑出2環(huán)至含300ml液體培養(yǎng)基的500ml搖瓶中活化培養(yǎng)，溫度25±2℃、100轉(zhuǎn)/分震蕩培養(yǎng)18小時，得到活化菌液；
b、制備種子液：將a步驟制得的活化菌液轉(zhuǎn)接到5l搖瓶中培養(yǎng)，5l搖瓶裝液量60%，接種量5%，溫度25±2℃、100轉(zhuǎn)/分震蕩培養(yǎng)24小時，得到種子菌液；
c、初級發(fā)酵培養(yǎng)：將b步驟制得的種子菌液導(dǎo)入(200l)一級種子發(fā)酵罐中，種子罐裝液量80%，接種量5%，控制通風(fēng)量0.2vvm，，攪拌轉(zhuǎn)速100轉(zhuǎn)/分，ph值控制在7.0，溫度25±2℃，培養(yǎng)24小時后，得到一級發(fā)酵菌種；
d、發(fā)酵培養(yǎng)：將c步驟制得的以及發(fā)酵菌種導(dǎo)入（10m3）三級發(fā)酵罐，三級發(fā)酵罐按60%裝液量，接種量5%，控制通風(fēng)量0.2vvm，過程ph值控制在7.0，溫度25±2℃，攪拌速度80轉(zhuǎn)/分，培養(yǎng)30小時后，制得石油烴降解菌發(fā)酵原液，其中烴降解菌菌數(shù)在2×108個/m以上；
上述搖瓶及發(fā)酵罐培養(yǎng)基配方是：液態(tài)石蠟0.5份、氯化銨2份、酵母粉0.2份、磷酸二氫鉀1.5份、七水硫酸鎂0.2份、氯化錳0.1份、氯化鈣0.2份、裝液量控制在80%、培養(yǎng)溫度25℃、控制通風(fēng)量0.2vvm，攪拌速度控制在50rpm，以上均為質(zhì)量份數(shù)；
以上均為質(zhì)量份數(shù)、質(zhì)量比和質(zhì)量百分比。
所述的生物聚合物菌發(fā)酵原液的制備方法如下：
a、菌種誘變：將野油菜黃單胞菌cgmcc1.1781接種過夜培養(yǎng)，制得待誘變發(fā)酵液，然后將待誘變發(fā)酵液進(jìn)行600微克/毫升ntg處理，按照1:1進(jìn)行混勻，25℃保溫30min，離心取下層細(xì)胞，洗滌細(xì)胞，于lb（luria-bertani）培養(yǎng)基中重懸、其細(xì)胞濃度為1.0×108～2.0×108個/ml，25℃培養(yǎng)過夜，稀釋涂板，選擇可在20～40℃溫度下，利用糖類為碳源產(chǎn)生生物復(fù)合多糖的菌種即為目標(biāo)菌種；
b、發(fā)酵液制備：
a、目標(biāo)菌種活化：斜面目標(biāo)菌種挑出2環(huán)至含100ml液體培養(yǎng)基的500ml搖瓶中活化培養(yǎng)，溫度25±2℃、150轉(zhuǎn)/分震蕩培養(yǎng)10小時，得到活化菌液；
b、制備種子液：a步驟制得的活化菌液轉(zhuǎn)接到5l搖瓶中培養(yǎng)，5l搖瓶裝液量20%，接種量10%，溫度25±2℃、150轉(zhuǎn)/分震蕩培養(yǎng)10小時，得到種子菌液；
c、一級發(fā)酵培養(yǎng)：將b步驟制得的種子菌液導(dǎo)入(100l)一級種子發(fā)酵罐中，種子罐裝液量50%，接種量10%，控制通風(fēng)量0.5vvm，攪拌轉(zhuǎn)速130轉(zhuǎn)/分，ph值控制在7.0～8.0，溫度25±2℃，培養(yǎng)8小時后，得到一級發(fā)酵菌種；
d、二級發(fā)酵培養(yǎng)：將c步驟制得的一集發(fā)酵菌種導(dǎo)入二級(1m3)種子罐，二級罐裝液量50%，接種量10%，控制通風(fēng)量0.5vvm，攪拌轉(zhuǎn)速100轉(zhuǎn)/分，ph值控制在7.0～8.0，溫度25±2℃，培養(yǎng)5小時，制得二級發(fā)酵菌液；
e、發(fā)酵培養(yǎng)：將d步驟制得的制得二級發(fā)酵菌液導(dǎo)入（10m3）三級發(fā)酵罐，三級發(fā)酵罐按50%裝液量，接種量10%，通風(fēng)量0.7vvm，過程ph值控制在7.0～8.5，溫度25±2℃，攪拌速度80轉(zhuǎn)/分，培養(yǎng)6小時后，即制得生物聚合物菌發(fā)酵原液，其中微生物復(fù)合多糖在微生物發(fā)酵液產(chǎn)品中占1.2%；
上述搖瓶及各級發(fā)酵罐培養(yǎng)基配方是：玉米糖漿10份、酵母膏5份、蛋白胨0.2份、磷酸二氫鉀1.5份、七水硫酸鎂0.3份、氯化鈣0.1份、裝液量為20%、培養(yǎng)溫度25±2℃、ph值7，攪拌速度控制在80rpm；
以上均為質(zhì)量份數(shù)、質(zhì)量比和質(zhì)量百分比。
實(shí)施例2
本發(fā)明的一種石油污染土壤修復(fù)劑體系，是由土壤調(diào)節(jié)液、石油烴降解菌劑、固體肥料載體、生物聚合物菌劑和營養(yǎng)液構(gòu)成，
所述的土壤調(diào)節(jié)液是由生物脂肽表面活性劑20份、腐殖酸溶液10份、雙氧水0.5份、水90份，混合均勻制得，其中腐殖酸溶液的質(zhì)量濃度為70%；
所述的石油烴降解菌劑是由5份的石油烴降解菌發(fā)酵原液與20份營養(yǎng)液，混合均勻制得；
所述的固體肥料載體是將秸稈、樹葉和廢棄果蔬殘余中的一種或者幾種的混合物粉碎為1～3mm顆粒，再與有機(jī)糞按質(zhì)量比10:0.5的配比混合，然后用質(zhì)量濃度為0.05%腐殖酸溶液浸潤，常溫25℃下，控制濕度50%，堆肥發(fā)酵2個月后的發(fā)酵混合物備用，使用前將發(fā)酵后的混合物與增氧劑按10：0.1混合配比制得，其中增氧劑是由過氧化鈣和過氧化尿素按質(zhì)量配比20：1混合而成；
所述的生物聚合物菌劑是由5份的生物聚合物菌發(fā)酵原液與20份營養(yǎng)液，混合均勻制得；
所述的營養(yǎng)液是由糖蜜1份、尿素1份、酵母粉0.1份、玉米漿干粉1份、磷酸氫二鉀0.5份、水99份，混合均勻制得；
以上均為質(zhì)量份數(shù)、質(zhì)量比和質(zhì)量百分比。
所述的石油烴降解菌發(fā)酵原液的制備方法如下：
a、菌種誘變：將地衣芽孢桿菌cgmcc1.7461接種過夜培養(yǎng)，制得待誘變發(fā)酵液，然后將待誘變發(fā)酵液進(jìn)行750微克/毫升ntg處理，按照1:1進(jìn)行混勻，25℃保溫30min，離心取下層細(xì)胞，洗滌細(xì)胞，于lb培養(yǎng)基中重懸、其細(xì)胞濃度為1.0×108～2.0×108個/ml，25℃培養(yǎng)過夜，稀釋涂板，選擇能夠在10℃～25℃溫度條件下，利用正十六烷、苯、菲和環(huán)己烷為單一碳源生長、對芳烴及環(huán)烷烴有較強(qiáng)的降解能力的菌種即為目標(biāo)菌種；
b、發(fā)酵液制備：
a、目標(biāo)菌種活化：斜面目標(biāo)菌種挑出2環(huán)至含300ml液體培養(yǎng)基的500ml搖瓶中活化培養(yǎng)，溫度25±2℃、100轉(zhuǎn)/分震蕩培養(yǎng)24小時，得到活化菌液；
b、制備種子液：將a步驟制得的活化菌液轉(zhuǎn)接到5l搖瓶中培養(yǎng)，5l搖瓶裝液量60%，接種量5%，溫度25±2℃、100轉(zhuǎn)/分震蕩培養(yǎng)30小時，得到種子菌液；
c、初級發(fā)酵培養(yǎng)：將b步驟制得的種子菌液導(dǎo)入(200l)一級種子發(fā)酵罐中，種子罐裝液量80%，接種量5%，控制通風(fēng)量0.3vvm，攪拌轉(zhuǎn)速100轉(zhuǎn)/分，ph值控制在8.0，溫度25±2℃，培養(yǎng)36小時后，得到一級發(fā)酵菌種；
d、發(fā)酵培養(yǎng)：將c步驟制得的以及發(fā)酵菌種導(dǎo)入（10m3）三級發(fā)酵罐，三級發(fā)酵罐按60%裝液量，接種量5%，控制通風(fēng)量0.3vvm，過程ph值控制在8.5，溫度25±2℃，攪拌速度80轉(zhuǎn)/分，培養(yǎng)48小時后，制得石油烴降解菌發(fā)酵原液，其中烴降解菌菌數(shù)在2×108個/m以上；
上述搖瓶及發(fā)酵罐培養(yǎng)基配方是：液態(tài)石蠟1份、、氯化銨3份、酵母粉0.4份、磷酸二氫鉀2份、七水硫酸鎂0.5份、氯化錳0.5份、氯化鈣0.5份、裝液量控制在80%、培養(yǎng)溫度30℃、控制通風(fēng)量0.3vvm，攪拌速度控制在80rpm，以上均為質(zhì)量份數(shù)；
以上均為質(zhì)量份數(shù)、質(zhì)量比和質(zhì)量百分比。
所述的生物聚合物菌發(fā)酵原液的制備方法如下：
a、菌種誘變：將野油菜黃單胞菌cgmcc1.1781接種過夜培養(yǎng)，制得待誘變發(fā)酵液，然后將待誘變發(fā)酵液進(jìn)行750微克/毫升ntg處理，按照1:1進(jìn)行混勻，25℃保溫30min，離心取下層細(xì)胞，洗滌細(xì)胞，于lb培養(yǎng)基中重懸、其細(xì)胞濃度為1.0×108～2.0×108個/ml，25℃培養(yǎng)過夜，稀釋涂板，選擇可在20～40℃溫度下，利用糖類為碳源產(chǎn)生生物復(fù)合多糖的菌種即為目標(biāo)菌種；
b、發(fā)酵液制備：
a、目標(biāo)菌種活化：斜面目標(biāo)菌種挑出2環(huán)至含100ml液體培養(yǎng)基的500ml搖瓶中活化培養(yǎng)，溫度25±2℃、150轉(zhuǎn)/分震蕩培養(yǎng)15小時，得到活化菌液；
b、制備種子液：a步驟制得的活化菌液轉(zhuǎn)接到5l搖瓶中培養(yǎng)，5l搖瓶裝液量20%，接種量10%，溫度25±2℃、150轉(zhuǎn)/分震蕩培養(yǎng)15小時，得到種子菌液；
c、一級發(fā)酵培養(yǎng)：將b步驟制得的種子菌液導(dǎo)入(100l)一級種子發(fā)酵罐中，種子罐裝液量50%，接種量10%，控制通風(fēng)量0.5vvm，攪拌轉(zhuǎn)速130轉(zhuǎn)/分，ph值控制在7.0～8.0，溫度25±2℃，培養(yǎng)13小時后，得到一級發(fā)酵菌種；
d、二級發(fā)酵培養(yǎng)：將c步驟制得的一集發(fā)酵菌種導(dǎo)入二級(1m3)種子罐，二級罐裝液量50%，接種量10%，控制通風(fēng)量0.6vvm，攪拌轉(zhuǎn)速100轉(zhuǎn)/分，ph值控制在8.0，溫度25±2℃，培養(yǎng)6小時，制得二級發(fā)酵菌液；
e、發(fā)酵培養(yǎng)：將d步驟制得的制得二級發(fā)酵菌液導(dǎo)入（10m3）三級發(fā)酵罐，三級發(fā)酵罐按50%裝液量，接種量10%，通風(fēng)量0.8vvm，過程ph值控制在8.5，溫度25±2℃，攪拌速度80轉(zhuǎn)/分，培養(yǎng)7小時后，即制得生物聚合物菌發(fā)酵原液，其中微生物復(fù)合多糖在微生物發(fā)酵液產(chǎn)品中占1.6%；
上述搖瓶及各級發(fā)酵罐培養(yǎng)基配方是：玉米糖漿20份、酵母膏7份、蛋白胨0.3份、磷酸二氫鉀2份、七水硫酸鎂0.5份、氯化鈣0.2份、裝液量為50%、培養(yǎng)溫度25±2℃、ph值8，攪拌速度控制在150rpm，以上為質(zhì)量份數(shù)；
以上均為質(zhì)量份數(shù)、質(zhì)量比和質(zhì)量百分比。
實(shí)施例3
本發(fā)明的一種石油污染土壤修復(fù)劑體系，是由土壤調(diào)節(jié)液、石油烴降解菌劑、固體肥料載體、生物聚合物菌劑和營養(yǎng)液構(gòu)成，
所述的土壤調(diào)節(jié)液是由生物脂肽表面活性劑15份、腐殖酸溶液5份、雙氧水0.3份、水70份，混合均勻制得，其中腐殖酸溶液的質(zhì)量濃度為70%；
所述的石油烴降解菌劑是由3份的石油烴降解菌發(fā)酵原液與18份營養(yǎng)液，混合均勻制得；
所述的固體肥料載體是將秸稈、樹葉和廢棄果蔬殘余中的一種或者幾種的混合物粉碎為2mm顆粒，再與有機(jī)糞按質(zhì)量比10:0.5的配比混合，然后用質(zhì)量濃度為0.05%腐殖酸溶液浸潤，常溫25℃下，控制濕度30～50%，堆肥發(fā)酵2個月后的發(fā)酵混合物備用，使用前將發(fā)酵后的混合物與增氧劑按10：0.1混合配比制得，其中增氧劑是由過氧化鈣和過氧化尿素按質(zhì)量配比20：1混合而成；
所述的生物聚合物菌劑是由3份的生物聚合物菌發(fā)酵原液與18份營養(yǎng)液，混合均勻制得；
所述的營養(yǎng)液是由糖蜜0.5份、尿素0.5份、酵母粉0.05份、玉米漿干粉0.5份、磷酸氫二鉀0.3份、水97份，混合均勻制得；
以上均為質(zhì)量份數(shù)、質(zhì)量比和質(zhì)量百分比。
所述的石油烴降解菌發(fā)酵原液的制備方法如下：
a、菌種誘變：將地衣芽孢桿菌cgmcc1.7461接種過夜培養(yǎng)，制得待誘變發(fā)酵液，然后將待誘變發(fā)酵液進(jìn)行700微克/毫升ntg處理，按照1:1進(jìn)行混勻，25℃保溫30min，離心取下層細(xì)胞，洗滌細(xì)胞，于lb培養(yǎng)基中重懸、其細(xì)胞濃度為1.0×108～2.0×108個/ml，25℃培養(yǎng)過夜，稀釋涂板，選擇能夠在10℃～25℃溫度條件下，利用正十六烷、苯、菲和環(huán)己烷為單一碳源生長、對芳烴及環(huán)烷烴有較強(qiáng)的降解能力的菌種即為目標(biāo)菌種；
b、發(fā)酵液制備：
a、目標(biāo)菌種活化：斜面目標(biāo)菌種挑出2環(huán)至含300ml液體培養(yǎng)基的500ml搖瓶中活化培養(yǎng)，溫度25±2℃、100轉(zhuǎn)/分震蕩培養(yǎng)18～24小時，得到活化菌液；
b、制備種子液：將a步驟制得的活化菌液轉(zhuǎn)接到5l搖瓶中培養(yǎng)，5l搖瓶裝液量60%，接種量5%，溫度25±2℃、100轉(zhuǎn)/分震蕩培養(yǎng)28小時，得到種子菌液；
c、初級發(fā)酵培養(yǎng)：將b步驟制得的種子菌液導(dǎo)入(200l)一級種子發(fā)酵罐中，種子罐裝液量80%，接種量5%，控制通風(fēng)量0.4vvm，攪拌轉(zhuǎn)速100轉(zhuǎn)/分，ph值控制在7.5，溫度25±2℃，培養(yǎng)30小時后，得到一級發(fā)酵菌種；
d、發(fā)酵培養(yǎng)：將c步驟制得的以及發(fā)酵菌種導(dǎo)入（10m3）三級發(fā)酵罐，三級發(fā)酵罐按60%裝液量，接種量5%，控制通風(fēng)量0.4vvm，過程ph值控制在8.0，溫度25±2℃，攪拌速度80轉(zhuǎn)/分，培養(yǎng)36小時后，制得石油烴降解菌發(fā)酵原液，其中烴降解菌菌數(shù)在2×108個/m以上；
上述搖瓶及發(fā)酵罐培養(yǎng)基配方是：液態(tài)石蠟0.7份、氯化銨2～3份、酵母粉0.3份、磷酸二氫鉀1.8份、七水硫酸鎂0.3份、氯化錳0.3份、氯化鈣0.3份、裝液量控制在80%、培養(yǎng)溫度28℃、控制通風(fēng)量0.4vvm，攪拌速度控制在70rpm，以上均為質(zhì)量份數(shù)；
以上均為質(zhì)量份數(shù)、質(zhì)量比和質(zhì)量百分比。
所述的生物聚合物菌發(fā)酵原液的制備方法如下：
a、菌種誘變：將野油菜黃單胞菌cgmcc1.1781接種過夜培養(yǎng)，制得待誘變發(fā)酵液，然后將待誘變發(fā)酵液進(jìn)行700微克/毫升ntg處理，按照1:1進(jìn)行混勻，25℃保溫30min，離心取下層細(xì)胞，洗滌細(xì)胞，于lb培養(yǎng)基中重懸、其細(xì)胞濃度為1.0×108～2.0×108個/ml，25℃培養(yǎng)過夜，稀釋涂板，選擇可在20～40℃溫度下，利用糖類為碳源產(chǎn)生生物復(fù)合多糖的菌種即為目標(biāo)菌種；
b、發(fā)酵液制備：
a、目標(biāo)菌種活化：斜面目標(biāo)菌種挑出2環(huán)至含100ml液體培養(yǎng)基的500ml搖瓶中活化培養(yǎng)，溫度25±2℃、150轉(zhuǎn)/分震蕩培養(yǎng)12小時，得到活化菌液；
b、制備種子液：a步驟制得的活化菌液轉(zhuǎn)接到5l搖瓶中培養(yǎng)，5l搖瓶裝液量20%，接種量10%，溫度25±2℃、150轉(zhuǎn)/分震蕩培養(yǎng)12小時，得到種子菌液；
c、一級發(fā)酵培養(yǎng)：將b步驟制得的種子菌液導(dǎo)入(100l)一級種子發(fā)酵罐中，種子罐裝液量50%，接種量10%，控制通風(fēng)量0.5vvm，攪拌轉(zhuǎn)速130轉(zhuǎn)/分，ph值控制在7.5，溫度25±2℃，培養(yǎng)10小時后，得到一級發(fā)酵菌種；
d、二級發(fā)酵培養(yǎng)：將c步驟制得的一集發(fā)酵菌種導(dǎo)入二級(1m3)種子罐，二級罐裝液量50%，接種量10%，控制通風(fēng)量0.55vvm，攪拌轉(zhuǎn)速100轉(zhuǎn)/分，ph值控制在7.5，溫度25±2℃，培養(yǎng)8小時，制得二級發(fā)酵菌液；
e、發(fā)酵培養(yǎng)：將d步驟制得的制得二級發(fā)酵菌液導(dǎo)入（10m3）三級發(fā)酵罐，三級發(fā)酵罐按50%裝液量，接種量10%，通風(fēng)量0.75vvm，過程ph值控制在8.0，溫度25±2℃，攪拌速度80轉(zhuǎn)/分，培養(yǎng)8小時后，即制得生物聚合物菌發(fā)酵原液，其中微生物復(fù)合多糖在微生物發(fā)酵液產(chǎn)品中占1.8%；
上述搖瓶及各級發(fā)酵罐培養(yǎng)基配方是：玉米糖漿15份、酵母膏6份、蛋白胨0.25份、磷酸二氫鉀1.8份、七水硫酸鎂0.4份、氯化鈣0.15份、裝液量為40%、培養(yǎng)溫度25±2℃、ph值7.5，攪拌速度控制在100rpm，以上為質(zhì)量份數(shù)；
以上均為質(zhì)量份數(shù)、質(zhì)量比和質(zhì)量百分比。
利用實(shí)施例1、實(shí)施例2或?qū)嵤├?所制得的一種石油污染土壤修復(fù)劑體系，其具體實(shí)施工藝操作步驟如下：先噴灑土壤調(diào)節(jié)液，每平方米噴灑1～4l；然后噴灑石油烴降解菌劑，每平方米噴灑1～4l后，鋪撒增氧劑（由過氧化鈣和過氧化尿素按質(zhì)量配比20：1混合而成），每平方米均勻鋪撒100～200g；再噴灑生物聚合物菌劑，每平方米噴灑1～2l后，鋪撒固體肥料載體顆粒1～2cm厚，最后再次噴灑生物聚合物菌劑，每平方米噴灑1～4l即可；噴灑的過程需按照順序和用量依次連續(xù)噴灑，對處理原油污染土壤，可定期按實(shí)際土壤濕度噴灑土壤調(diào)節(jié)液及石油烴降解菌營養(yǎng)液，控制土壤濕度30%～50%，可提高原油降解時間。