專利名稱：：通過內源校準物對待分析物進行偶聯的酶免疫化學測定的方法通過內源校準物對待分析物進行偶聯的酶免疫化學測定的方法
技術領域：
：本發(fā)明涉及通過分析元件對生物樣品和其它液體樣品中的多種待分析物(例如代謝物和抗原)進行測定的方法，所述分析元件特別是側向流動測試帶(lateral-flowteststrip)、流通膜體系(流通測試)、微量滴定板或試管的孔/洞。本發(fā)明的應用領域主要是醫(yī)學診斷學、制藥工業(yè)和環(huán)境保護。用于測定生物學液體中的多種待分析物或用于測定環(huán)境樣品中的污染物的分析元件(例如免疫-色譜測試體系)已經已知數年，在實踐中其被證明是非常成功的。它們主要根據夾層原理或競爭原理(在小分析物的情況下)工作。親和測定法(例如免疫測定法、受體和DNA測定法)的使用對于臨床和大量其它應用來說正越來越重要。在該情況下，非常不同的待分析物在不同的樣品基質(例如尿、唾液、淚液、汗、液體(liquor)或血)中被測定。但目前仍存在下述問題，至少一部分所述基質(例如尿)的稀釋度不是恒定的；因此，在一天的過程中發(fā)生明確的濃度改變，這影響相應的待分析物的測量值。然而，內源形成的物質是針對個體身體基質來描述的，在它的幫助下可以校正相應的稀釋度；因此，體系可以被校準(Federalhealthsheet—healthresearch_healthprotection52005;NorpothK,HegerM(1984)，Creatinineasareferencevariableforindicatingsubstanceconcentrationsintheurea.In:HentschlerD,LehnertG(Hrsg)BiologicalAgentToleranceValues(BATvalues),occupationalmedicaltoxicologicalgrounds,Vol.1,Commissionforthetestingofhealth-hazardousbiologicalagentsoftheDFG)。樣品基質尿中的肌酸酐是作為內源校準物(calibrator)作用的這些物質的一個例子。在健康測試受試者自發(fā)產生的尿樣的情況下，每升尿4到28mmol之間的肌酸酐濃度波動是非常正常的(FimdamentalsofLaboratoryTesting:Urine，RocheDiagnosticsGmbH,Mannheim,Germany)。如果將這些值與24小時尿的平均值(15mmol/l)相比，那么很清楚因數為3.5的稀釋度是正常范圍，但是尿也可以以因數2被濃縮。以樣品基質尿中待測定的待分析物為基礎，這表示測定的測量值必須相應地被校正，因此雙重測定(內源校準物和分析物)之后必須進行計算。在實踐中，這表示進行兩個獨立的測試。在尿的情況下，首先通過酶級聯放大測定肌酸酐濃度，然后在第二階段(通常免疫化學地)測定待分析物的體積。該方法是既耗時又費力的。因此，本發(fā)明的目的是發(fā)現用于下述測試體系的新溶液，所述測試體系測定樣品基質中的多種待分析物，所述樣品基質具有不恒定的濃度。本發(fā)明根據權利要求完成。其涉及通過分析元件來測定生物樣品或其它液體樣品中的多種待分析物(例如代謝物和抗原)的方法，所述分析元件特別是側向流動測試帶、流通膜體系(流通測試)、微量滴定板或試管的孔/洞，本發(fā)明的方法以偶聯的酶和親和反應為基礎，并借助于內源校準物實現。借助于所述內源校準物(例如肌酸酐、葡萄糖、葡萄糖-6-磷酸鹽、乳酸鹽、谷氨酸鹽、天冬氨酸鹽、膽固醇、丙酮酸鹽、尿素和甘油三酯)能夠校正樣品基質的稀釋度。主要的構想由偶聯酶和免疫化學方法組成，其包括由獲得的體系自動校正總結果中相應樣品基質的內源校準物濃度、分析物濃度。使用該組合的酶/免疫學測試體系，將體液與酶混合物孵育(反應1)，此時通過內源校準物轉化孵育產生的過氧化氫(11202)被部分或完全地用于用相同體液進行的第二輪、即刻的免疫反應(反應2)中，以通過標記物酶形成信號。獲得該信號，將其與第一反應中產生的&02信號比較或抵消。該方法的兩個反應可以同時或先后進行，也可以在一個區(qū)室或兩個獨立的區(qū)室中進行。優(yōu)選地，使用側向流動測試帶、流通膜體系(流通測試)、微量滴定板或試管的孔/洞作為區(qū)室。根據本發(fā)明，通過視覺(裸眼)、比色法、通過熒光或電化學獲得信號。評價借助于計算圖、比色器(參考帶)、讀數器或使用肉眼的比較進行，在后者的情況下，由校準物經酶促產生的信號數(例如測試線或測試點)被設定為針對由待分析物經免疫學產生的信號數(例如測試線或測試點)的比例。'使用該新方法，可以研究體液，包括尿、唾液、淚液、汗、液體或血。肌酸酐、葡萄糖、葡萄糖-6-磷酸鹽、乳酸鹽、谷氨酸鹽、天冬氨酸鹽、膽固醇、丙酮酸鹽、尿素和甘油三酯被尤其用作內源校準物。標記物酶優(yōu)選是過氧化物酶和氧化酶。優(yōu)選地，使用酶混合物，所述酶混合物與體液中存在的涉及&02形成的內源校準物反應。例如，在體液尿的情況下，當使用肌酸酐作為內源校準物時，使用肌酸酐酶、肌酸酶和肌氨酸氧化酶的混合物。然而，如果在相同的樣品基質中使用葡萄糖作為內源校準物，則使用葡萄糖氧化酶產生11202。令人驚奇的是，我們發(fā)現，在具有非恒定濃度的樣品基質中使用這樣的組合體系，能夠以可靠的方式(即用相應的稀釋度校正)直接測定非常大范圍的待分析物。接著借助圖解在下文中更詳細地解釋本發(fā)明。實施例實施例1用側向流動測試體系在樣品基質尿中測定心臟特異脂肪酸結合蛋白(TABP)同時借助于內源校準物(肌酸酐)進行校正(見圖l、3、4和化將尿樣(200)iil)分為2等份(A和B)。將A部分引入試管中(見圖3)，所述試管含有凍干形式的以下酶混合物(每20pl):肌酸酐酶(18.8U/ml)、肌酸酶(7.5U/ml)和肌氨酸氧化酶(11.3U/ml)。搖動試管并在室溫(20-25。C)下孵育20分鐘。存在于尿中的內源肌酸酐被以此種方式重建的酶混合物轉化為過氧化氫(11202)和其它物質(見圖1)。B部分首先被商業(yè)蛋白質穩(wěn)定劑進行l(wèi):4稀釋，然后取50jil應用于測試帶上(圖4:樣品開口1)。在樣品開口1下固定的抗-FABP/辣根過氧化物酶綴合物從其基質中被溶解出來，與分析物形成絡合物(FABP-抗-FABP/辣根過氧化物酶)，并以此種形式流過測試區(qū)域，另一種抗-FABP抗體被固定在所述測試區(qū)域上作為接收器(catcher)。存在FABP時，后者與所提到的絡合物結合，作為分析物濃度的函數。應用B部分后20分鐘，向樣品開口2中引入100^tl預孵育的A部分。因此，測試帶上被固定的無H202并且局部嚴格受限制沉淀的過氧化物酶底物被溶解，并與11202(得自肌酸酐的轉化)一起流過測試區(qū)域。如果達到接收器線的位置，則液體的、無色的底物立刻被轉化為藍色/紫色沉淀物。沉淀物(即產生的信號)的體積是分析物濃度和內源校準物體積的函數，所述內源校準物被用于產生反應必需的H202。高度內源的校準物(濃縮的晨尿)產生比具有平均校準物濃度和相同分析物濃度的樣品(日間尿)更強的信號。所述的測試體系通過其作用的方式校正了該效應，并且在該情況下，允許借助于比色卡記錄真正的分析物濃度(見圖6)。實施例2用基于微量滴定板的大點測定法在樣品基質尿中測定FABP同時借助于內源校準物(葡萄糖)進行校正(見圖2和5)用商業(yè)膜包裹的微量滴定板(96孔)進行大點測定法(圖5/1)。優(yōu)選地，膜材料由PVDF或硝酸纖維素組成。使用的點模型取決于涉及的應用；例子在圖5/2中闡述。優(yōu)選地，使用5個點(圖5/3)，一般中央的點作為對照點作用。外部的點可以被用于測定不同的分析物和用于個體分析物濃度的稀釋度校正。要被描述的例子涉及對個體分析物(FABP)的測定和使用的樣品基質(尿)稀釋度的同時校正。使用含有不同濃度抗-FABP抗體(接收器)的4個點(見圖5，中央部分)。將尿樣(400pl)分為2等份(A和B)。將A部分引入試管中，所述試管含有6.5U葡萄糖氧化酶和0.5mM葡萄糖。必須單獨地添加小的、固定量的葡萄糖，以產生基底水平的&02。搖動試管并在室溫(20-25。C)下孵育60分鐘。存在于尿中的內源葡萄糖被轉化為過氧化氫(11202)和其它物質(見圖2)。首先用商業(yè)的蛋白質穩(wěn)定劑以1:10稀釋B部分。制造以下的反應混合物<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>向每孔中添加100pl反應混合物，在室溫(20-25。C)下孵育60分鐘。添加FABP使得作用能夠更清楚地被描述。只有存在FABP時才能在接收器抗體上形成以下絡合物接收器抗體/FABP/抗FABP抗體辣根過氧化物酶綴合物。然后將平板洗滌4次(0.1MNa-P緩沖液，pH7.2)，并向每孔中添加50[ll的以下混合物1部分A部分1部分不含11202的、局部嚴格受限制沉淀的過氧化物酶底物。然后在室溫下孵育至少5分鐘。在該情況下，在結合辣根過氧化物酶的位置處，液體、無色的底物被轉化為藍色的沉淀物，沉淀物的體積(即產生的信號)取決于分析物濃度和內源校準物(葡萄糖)的體積，所述內源校準物被用于產生反應必需的11202。然后將平板再洗滌4次(如上)。干燥后使用例如成像工藝進行評價。圖5顯示了無FABP添加(4)和有FABP添加(5)的RGB圖，還顯示了無FABP添加(6)和有FABP添加(7)的灰色比例圖用于評價。定量發(fā)生于后圖的基礎上，所述后圖的數據在表1中給出。該自我校準測定法的作用通過向兩種尿樣中添加100ng/mlFABP而變得清楚。從最后一行看出使用的晨尿與日間尿相比被濃縮了1.74倍。參照它們的動力學，來評價通過使用的模型與接收器抗體(1;2;4和8ng/ml)產生的信號。在1ng/ml接收器抗體的強信號后，從2ng/ml接收器抗體開始，發(fā)生了連續(xù)的信號上升至飽和。在日間尿中相同的分析物濃度下，飽和更容易達到，因為該非濃縮的樣品含有更少的內源校準物(在該情況下為葡萄糖)，并因此進能夠形成更小量的H202。因此，可以針對特征性相對濃度范圍數學地描述飽和曲線，并在評價軟件中完成。然后通過比較飽和曲線進行樣品中分析物的校正濃度測定。表l:圖5中所示結果的定]<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>實施例3用于測定分析物同時借助于針對多種樣品基質的內源校準物進行校正的流通大點測定法(圖7)實施例3描述了用于測定分析物同時借助于針對多種樣品基質的內源校準物進行校正的流通大點測定法的應用。在該情況下，首先將7個點用于流通膜體系(比較圖7)。點'1，到'4，含有對照點，并且，優(yōu)選地含有抗小鼠免疫球蛋白G或蛋白A。點'EK'被用于測定相應的內源校準物，并因此優(yōu)選地由個體酶或酶混合物以及過氧化物酶組成。點'EK-tJ'是任選的，并且被使用時含有最適合該應用的濃度的相應校準物(例如肌酸酐或葡萄糖)，還含有將校準物轉化為11202必需的組分。向所有的點中添加局部嚴格受限沉淀的過氧化物酶底物。使用該測試體系時，首先在試管中預孵育樣品，所述試管含有轉化涉及的內源校準物必需的酶混合物，或相應的個體酶，以及辣根過氧化物酶偶聯的抗-分析物抗體。然后將該反應混合物應用于流通膜體系的測試區(qū)域。如果分析物存在于樣品中，則分析物-辣根過氧化物酶偶聯的抗分析物抗體與相應的接收器抗體(點T到'4，)結合。因為不同的接收器抗體濃度，飽和發(fā)生在點'4，的方向。通過反應混合物中內源校準物的轉化形成的產物(優(yōu)選H202)立刻啟始無H202，、局部嚴格受限沉淀的過氧化物酶底物從其無色的初級階段到藍色/紫色沉淀物的轉化，所述過氧化物酶底物預先被固定在每個點中。在該情況下，沉淀物體積取決于例如局部存在的過氧化物酶和11202濃度。權利要求1.組合的酶/免疫學測試方法，其特征在于，用酶混合物孵育體液(反應1)，將通過內源校準物轉化孵育產生的產物(例如，過氧化氫(H2O2))部分地用于采用相同體液的第二輪、即刻的免疫反應性(反應2)中，以通過標記物酶形成信號，獲得該信號并與第一反應中產生的產物(例如H2O2)的信號比較或抵消。2.根據權利要求1的測試方法，其特征在于，所述兩個反應同時平行進行或先后進行。3.根據權利要求1-2的測試方法，其特征在于，所述兩個反應在一個區(qū)室中或在2個獨立的區(qū)室中進行。4.根據權利要求3的測試方法，其特征在于，所述區(qū)室尤其是側向流動測試帶、流通膜體系(流通測試)、微量滴定板或試管的孔/洞。5.根據權利要求1-4中任一項的測試方法，其特征在于，通過視覺(裸眼)、比色法、通過熒光或電化學獲得信號。6.根據權利要求5的測試方法，其特征在于，所述評價借助于計算圖、比色器(參考帶)、讀數器或使用肉眼的比較進行，在后者的情況下，由校準物經酶產生的信號數(例如測試線或測試點)被設定為針對由分析物經免疫學產生的信號數(例如測試線或測試點)的比例。7.根據權利要求1-6中任一項的測試方法，其特征在于，尤其使用尿、唾液、淚液、汗、液體、血清、血漿或血作為體液。8.根據權利要求1-7中任一項的測試方法，其特征在于，使用肌酸酐、葡萄糖、葡萄糖-6-磷酸鹽、乳酸鹽、谷氨酸鹽、天冬氨酸鹽、膽固醇、丙酮酸鹽、尿素和甘油三酯，以及酶如a-淀粉酶和離子如鈣、鉀和鎂離子作為內源校準物。9.根據權利要求1-8中任一項的測試方法，其特征在于，使用過氧化物酶和氧化酶作為標記物酶。10.根據權利要求1-9中任一項的測試方法，其特征在于，優(yōu)選地，使用酶混合物，所述酶混合物與存在于體液中涉及H202形成的內源校準物反應。11.根據權利要求1-10中任一項的測試方法，其特征在于，使用的內源校準物也可以以恒定的、最適的濃度被添加進所述反應混合物中用于所涉及的應用。12.根據權利要求11的測試方法，其特征在于，在體液尿的情況下，當使用肌酸酐作為內源校準物時使用肌酸酐酶、肌酸酶、肌氨酸氧化酶的混合物，當使用葡萄糖作為內源校準物時使用葡萄糖氧化酶。全文摘要本發(fā)明涉及通過分析元件對生物樣品和其它液體樣品中的多種待分析物(例如代謝物和抗原)進行測定的方法，所述分析元件特別是側向流動測試帶、流通膜體系(流通測試)、微量滴定板或試管的孔/洞，本發(fā)明的方法以偶聯的酶和親和反應為基礎，并借助于內源校準物(即內源生產的物質)完成，借助于所述內源校準物(例如肌酸酐、葡萄糖、葡萄糖-6-磷酸鹽、乳酸鹽、谷氨酸鹽、天冬氨酸鹽、膽固醇、丙酮酸鹽、尿素和甘油三酯)能夠校正樣品基質的稀釋度。本發(fā)明的應用領域主要是醫(yī)學診斷學、制藥工業(yè)和環(huán)境保護。優(yōu)選地，本發(fā)明涉及對抗原和代謝物的同時或先后測定。在本發(fā)明的含義中，它們主要是高分子抗原(如蛋白質)或低分子半抗原，例如殺蟲劑、新蝶呤、污染物或激素，以及，在代謝物的情況下例如為葡萄糖或肌酸酐。結果可借助于計算圖、比色器(參考帶)、讀數器的幫助從測定法直接確定，或通過用肉眼比較來確定。文檔編號G01N33/543GK101421620SQ200780001817公開日2009年4月29日申請日期2007年5月7日優(yōu)先權日2006年5月8日發(fā)明者喬治·W·H·克瑟里,馮嘉琪,卡林·萊瑪恩,坎杰爾·P·Y·陳,里恩哈德·仁尼伯格,麥特瑟斯·萊瑪恩申請人:八新思生物技術有限公司