專(zhuān)利名稱(chēng)：Vap-1抑制劑用于治療纖維變性疾病的用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及VAP-I的抑制劑及其作為抗纖維變性劑的用途。此外，本發(fā)明涉及診斷纖維變性疾病的方法以及用于所述診斷方法的試劑盒。
背景技術(shù)：
纖維變性疾病通常在創(chuàng)傷或慢性炎癥后作為受干擾的傷口愈合過(guò)程的結(jié)果存在。纖維變性病理在定期暴露于化學(xué)和生物損害的器官，例如肝、肺、皮膚和腎中特別常見(jiàn)。無(wú)論病癥是急性的還是慢性的，它們都具有共同的特征，即異常的成纖維細(xì)胞活化和胞外基質(zhì)(ECM)的積累，導(dǎo)致器官功能的喪失，因?yàn)轳：劢M織替代了正常組織。該疾病是漸進(jìn)的，常常是不可逆，具有差的預(yù)后和存活率。不考慮損傷的原因，纖維變性瘢痕的組成與損傷非常類(lèi)似。纖維變性嚴(yán)重程度的診斷和驗(yàn)證從預(yù)后觀(guān)點(diǎn)看極其重要。治療的決策過(guò)程高度取決于對(duì)纖維變性的評(píng)估、其進(jìn) 程以及并發(fā)癥的發(fā)作。在肝纖維變性中，經(jīng)皮的肝活組織檢查是分級(jí)和分期肝病的金標(biāo)準(zhǔn)。然而，這是侵入性操作，通常具有與疼痛和不適相關(guān)的某些不可避免的風(fēng)險(xiǎn)和并發(fā)癥。死亡率(歸因于該操作的并發(fā)癥)為1:1000至1:10000 (Crockett等人，2006)。發(fā)現(xiàn)血清單胺氧化酶活性水平在患與纖維變性相關(guān)的肝硬化、慢性肝炎和肝癌的患者中升高，但發(fā)現(xiàn)在患炎性結(jié)締組織疾病例如類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎或系統(tǒng)性紅斑狼瘡的患者中是正常的(McEwen 和 Castell 1967，J Lab Clin Med. 70 :36-47 ;Ito 等人1971Digestion. 4 :49-58 ;Ma Lin 等人，1976，Proc Soc Exp Biol Med. 151:40-3)。然而，已經(jīng)考慮將升高的血清單胺氧化酶活性?xún)H作為標(biāo)志物或者作為對(duì)組織損傷的應(yīng)答，并且其在纖維變性的發(fā)病機(jī)理中的作用還未知。常規(guī)的治療方法使用皮質(zhì)類(lèi)固醇和免疫抑制藥物，主要靶向纖維變性的炎癥過(guò)程。然而，不幸的是這些藥劑具有很少的臨床效果或者沒(méi)有臨床效果，并且存在治療纖維變性疾病的新藥物的明顯需求。發(fā)明簡(jiǎn)述本發(fā)明的一些目的涉及作為抗纖維變性劑的VAP-I抑制劑、VAP-I抑制劑用于生產(chǎn)治療纖維變性疾病的藥物的用途，以及在需要其的人類(lèi)受試者中預(yù)防、治療或者減輕纖維變性疾病的方法，所述方法包括將有效量的VAP-I抑制劑施用給所述患者。本發(fā)明另外的目的是提供在受試者中診斷纖維變性疾病的方法。該方法包括a)提供來(lái)自所述受試者的體液樣品，b)在所述樣品中測(cè)定可溶性VAP-I (sVAP-1)的量或者SSAO活性，c)基于sVAP-1的所述量或者SSAO活性診斷纖維變性。根據(jù)需要，可以將sVAP_l的量或者SSAO活性與參照體液中sVAP-1的量或者SSAO活性比較。本發(fā)明另外的目的是提供在診斷纖維變性疾病的方法中使用的試劑盒。在上述目的的一些實(shí)施方案中，VAP-I抑制劑是抗VAP-I抗體，例如包含選自SEQID NO 1-3的1-3個(gè)⑶R共有序列的完全人的抗VAP-I抗體和/或包含選自SEQ ID NO24-26的1-3個(gè)CDR共有序列的輕鏈多肽。在一些其他的實(shí)施方案中，所述抗VAP-I抗體具有包含選自SEQ ID N04-8的第一⑶R序列、選自SEQ ID NO 9-13的第二⑶R序列和選自SEQID NO 14-18的第三CDR序列的重鏈多肽和/或包含選自SEQ ID N027-31的第一 CDR序列、選自SEQ ID NO 32-36的第二 CDR序列和選自SEQ ID NO 37-41的第三CDR序列的輕鏈多肽。在一些另外的實(shí)施方案中，所述抗VAP-I抗體具有包含選自SEQ IDNO 19_23的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)和包含選自SEQ ID NO 42-46的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)。又在一些另外的實(shí)施方案中，所述抗體是重組的完全人重組抗體，其包含在SEQ ID NO 47中所述的重鏈多肽和在SEQ IDNO 48中所述的輕鏈多肽。在上述目的的一些其他實(shí)施方案中，VAP-I抑制劑是SSAO抑制劑，例如選自肼衍生物、丙烯基胺和炔丙基胺、4-取代的-2- 丁炔基胺、鹵代烯丙基胺、吡咯啉衍生物、炔丙基二胺、烯丙基胺、二胺、4，5，6，7-四氫咪唑并[4，5-c]吡啶衍生物、氨基硫羰基衍生物、羧 酰胺、磺酰胺、噻唑和/或胍衍生物、肟衍生物、二肼、芳基烷基胺(arylalkylamine)惡唑烷酮、鹵代烷基胺、苯磷硫胺和咪唑并吡啶衍生物。在上述目的的一些另外的實(shí)施方案中，纖維變性疾病選自肝纖維變性和誘發(fā)其的炎癥疾病，即急性和慢性肝炎、膽道疾病和中毒性肝損傷、肺纖維變性、腎纖維變性，包括糖尿病性腎病導(dǎo)致的腎纖維變性，骨髓纖維變性、胰纖維變性、硬皮病、結(jié)締組織疾病、瘢痕、皮膚纖維變性、心臟纖維變性、器官移植、血管狹窄、再狹窄、動(dòng)脈纖維變性、關(guān)節(jié)纖維變性(arthrofibrosis)、乳房纖維變性、肌肉纖維變性、腹膜后纖維變性、甲狀腺纖維變性、淋巴結(jié)纖維變性、膀胱纖維變性、胸膜纖維變性和C0PD，所述COPD是這樣的疾病，其中氣管壁隨成肌纖維細(xì)胞和膠原的積累而纖維變性，并且與所有纖維變性組織一樣，是收縮的。本發(fā)明的其他特定實(shí)施方案描述于所附權(quán)利要求中。本發(fā)明的其他目的、細(xì)節(jié)和優(yōu)點(diǎn)從以下附圖、詳細(xì)說(shuō)明和實(shí)施例中看是顯而易見(jiàn)的。附圖簡(jiǎn)述以下，本發(fā)明將參照附圖通過(guò)優(yōu)選的實(shí)施方案更加詳細(xì)地描述，附圖中圖I顯示施用VAP-I抗體BTT-1029導(dǎo)致了對(duì)CCI4誘導(dǎo)的肝纖維變性的幾乎完全保護(hù)。來(lái)自用礦物油(MO，對(duì)照組)、CCI4或CCI4與VAP-I抗體平行注射的WT和VAP-1敲除小鼠的Sirus red染色。使用Image J閾值分析進(jìn)行纖維變性瘢痕的定量測(cè)量。顯示了3組實(shí)驗(yàn)的平均值土SEM。放大倍數(shù)X 10。圖2顯示盡管進(jìn)行了 CC14-纖維變性誘導(dǎo)，但VAP-I抗體處理的肝和VAP-I敲除肝都顯示明顯缺少肝炎和壞死區(qū)域。顯示了在X20放大倍數(shù)下，突出壞死肝細(xì)胞(箭頭)和正在進(jìn)行的肝炎(箭頭)的蘇木精和伊紅染色。圖3顯示VAP-I抗體阻止了在纖維變性組織中膠原蛋白IV和彈性蛋白表達(dá)的增力口。使用Image J閾值分析進(jìn)行膠原蛋白IV、彈性蛋白和層粘連蛋白染色的定量測(cè)量。顯示了 3組實(shí)驗(yàn)的平均值土SEM。圖4圖解了 mRNA水平表明VAP-1對(duì)肝星形細(xì)胞和成纖維細(xì)胞的調(diào)節(jié)作用。顯示了彈性蛋白、aSMA、VAP-I和TMPl的定量RT-PCR分析。數(shù)據(jù)顯示為來(lái)自測(cè)量了 3次的3只小鼠的平均值 +SEM0 *p < 0. 05、**< 0. 01、…< 0. OOl(ANOVA)。圖5顯示應(yīng)答CCI4誘導(dǎo)的肝纖維變性增加的血清中可溶性VAP-I和SSAO活性。圖5A圖解了用時(shí)間分辨熒光DELFIA測(cè)定法分析的血清中CCI4誘導(dǎo)的肝纖維變性對(duì)可溶性VAP-I水平的影響。圖5B顯示用放射化學(xué)測(cè)定法，在來(lái)自CCI4誘導(dǎo)的WT肝的血清中發(fā)現(xiàn)的SSAO活性的增加水平。圖6顯示了在VAP-I敲除小鼠和VAP-I抗體處理的C57BL/6小鼠中拯救的由CCI4誘導(dǎo)的腎小球病變。顯示了在X40放大倍數(shù)下，突出腎小球的蘇木精和伊紅染色。圖7圖解了在VAP-I敲除小鼠和VAP-I抗體處理的小鼠中膠原蛋白積累顯著降低(由于CCI4誘導(dǎo)的腎小球纖維變性)。顯示了來(lái)自用礦物油(MO，對(duì)照組)、CCI4或CCI4與VAP-I抗體平行注射的WT和VAP-I敲除小鼠的Sirus red染色。使用Image J閾值分析進(jìn)行纖維變性瘢痕的定量測(cè)量。顯示了 3組實(shí)驗(yàn)的平均值土SEM。放大倍數(shù)X40。圖8圖解了與運(yùn)載體處理的小鼠比較，來(lái)自VAP-I抗體(BTT-1029)處理的煙草煙暴露的小鼠的支氣管肺泡灌洗液中總細(xì)胞數(shù)的降低。圖9圖解了與運(yùn)載體處理的小鼠比較，來(lái)自對(duì)照羅氟司特處理的煙草煙暴露的小 鼠的支氣管肺泡灌洗液中總細(xì)胞數(shù)的降低。

圖10顯示與NaCl 0. 9%處理的對(duì)照組比較，在地塞米松處理組和兩個(gè)SSAO抑制劑(BTT-2089)處理組中血管中層形成的顯著減少。圖11顯示與NaCl 0. 9%處理的對(duì)照組比較，在地塞米松處理組和兩個(gè)SSAO抑制劑(BTT-2089)處理組中新內(nèi)膜形成的顯著減少。圖12顯示蘇木精根皮紅藏紅花(hematoxylin phloxine saffron) (HPS)染色的血管區(qū)段的實(shí)例。當(dāng)與對(duì)照組比較時(shí)，在SSAO抑制劑處理組C和D中管腔尺寸是增加的。A-NaCl 0. 9% 組；B -地塞米松；C-BTT208910mg/kg ；D-BTT-2089 30mg/kg。圖13顯示用抗VAP-I抗體或同種型匹配的對(duì)照抗體染色的來(lái)自正常、NASH肝硬化和ALD肝硬化肝的組織。VAP-I染色顯示，與正?；蛲N型對(duì)照比較，在NASH肝硬化和ALD肝硬化肝中更深，并且反映了纖維變性區(qū)域中VAP-I表達(dá)的增加。圖14顯示用抗VAP-I、抗⑶31和抗膠原蛋白IV抗體染色的來(lái)自正常的和NASH肝硬化肝的組織。VAP-I染色用箭頭顯示，并且其主要僅存在于NASH肝硬化肝中，并反映了纖維變性區(qū)域中VAP-I表達(dá)的增加。圖15顯示用抗VAP-1、抗⑶90和抗⑶3抗體染色的來(lái)自NASH肝硬化肝的組織。VAP-I染色用箭頭顯示，并且其存在于NASH肝硬化肝中，并反映了纖維變性區(qū)域中VAP-I表達(dá)的增加。圖16顯示用抗VAP-I和抗平滑肌肌動(dòng)蛋白抗體染色的肝星形細(xì)胞，以及用抗VAP-1、抗CD90和抗膠原蛋白IV抗體染色的肝肌成纖維細(xì)胞。VAP-I染色用箭頭顯示，并且其存在于肝星形細(xì)胞和肝肌成纖維細(xì)胞中。圖17是sVAP-1水平與相應(yīng)的組織學(xué)纖維變性階段的散點(diǎn)圖。直線(xiàn)表示中值。圖18顯示將sVAP-1用作為單獨(dú)的生物標(biāo)志物以預(yù)測(cè)顯著的肝纖維變性(F2-4)(圖18A)、晚期的纖維變性(F3-4)(圖18B)和肝硬化(F4)(圖18C)的受者作用特征(ROC)曲線(xiàn)。圖19顯示從sVAP-1水平、糖尿病狀態(tài)和AST/ALT比率(0. 837 + sVAP-1 (ng/ml) X0. 001 +糖尿病(是=1否=0) X0. 591 + logAST/ALTXO. 8)計(jì)算的纖維變性得分的受者作用特征(ROC)曲線(xiàn)，以預(yù)測(cè)顯著的肝纖維變性(F2-4)(圖19A)、晚期的纖維變性(F3-4)(圖19B)和肝硬化(F4)(圖19C)。發(fā)明詳述
本發(fā)明基于令人意外的發(fā)現(xiàn)，即血管黏著蛋白-I(VAP-I)(也稱(chēng)為氨基脲敏感的胺氧化酶(SSAO)并由人類(lèi)基因A0C3定義)在纖維變性組織的形成中起著直接的作用。到目前為止，VAP-I已經(jīng)顯示出通過(guò)介導(dǎo)白細(xì)胞遷移進(jìn)入組織，參與多種炎癥疾病，但還沒(méi)有顯示出直接參與纖維變性本身的發(fā)病機(jī)理。術(shù)語(yǔ)“纖維變性”指在器官或組織中形成了或者存在過(guò)多的結(jié)締組織。其可能以對(duì)刺激例如組織損傷或者炎癥的修復(fù)或者替代應(yīng)答的形式發(fā)生。本發(fā)明的一個(gè)目的是研究VAP-I抑制劑在保護(hù)多種器官免于纖維變性損傷中的作用。例如，在小鼠中由四氯化碳造成的慢性纖維變性肝損傷中、在慢性阻塞性肺病(COPD)的煙草煙誘導(dǎo)的小鼠模型中和在血管重構(gòu)、血管狹窄和新內(nèi)膜變厚(纖維變性)的小鼠模型中，已經(jīng)獲得了極好的結(jié)果。因此，可以實(shí)際上將VAP-I抑制劑作為抗纖維變性劑。在一個(gè)方面，本發(fā)明的實(shí)施方案因此提供了通過(guò)給需要該治療的人類(lèi)患者使用有效水平的VAP-I抑制劑，在人類(lèi)身體中，體內(nèi)減輕或治療纖維變性的方法。術(shù)語(yǔ)“治療”意圖 包括以這樣的目的將VAP-I抑制劑施用給受試者，所述目的可以包括預(yù)防、改善、防止或者治愈涉及纖維變性的疾病，例如肝纖維變性和誘發(fā)其的炎癥疾病，即急性和慢性肝炎、膽道疾病和中毒性肝損傷、肺纖維變性、腎纖維變性，包括糖尿病性腎病導(dǎo)致的腎纖維變性、骨髓纖維變性、胰纖維變性、硬皮病、結(jié)締組織疾病、瘢痕、皮膚纖維變性、心臟纖維變性、器官移植、血管狹窄、再狹窄、動(dòng)脈纖維變性、關(guān)節(jié)纖維變性(arthrofibrosis)、乳房纖維變性、肌肉纖維變性、腹膜后纖維變性、甲狀腺纖維變性、淋巴結(jié)纖維變性、膀胱纖維變性、胸膜纖維變性和C0PD，所述COPD是這樣的疾病，其中氣管壁隨肌成纖維細(xì)胞和膠原的積累而纖維變性，并且與所有纖維變性組織一樣，是收縮的。VAP-I抑制劑的“有效水平”意為至少改善纖維變性的有害作用的水平?？梢酝ㄟ^(guò)治療纖維變性相關(guān)疾病的臨床領(lǐng)域的普通技術(shù)人員容易地確定VAP-I抑制劑的施用量和方案。優(yōu)選地，VAP-I抑制劑是單克隆抗VAP-I抗體，其以每周一次至每三月一次的間隔，以0. 01至20mg/kg,更優(yōu)選地以0. I至15mg/kg,最優(yōu)選地以I. 0至10mg/kg的劑量靜脈內(nèi)提供。備選地，以每周一次至每三月一次的間隔，以0. I至20mg/kg，優(yōu)選地以0. 2至IOmg/kg，最優(yōu)選地0. 5至5mg/kg的劑量皮下提供VAP-I抑制劑。可以以約0. I ii g/kg至約300mg/kg的劑量之內(nèi)，優(yōu)選地I. 0 ii g/kg至10mg/kg之間的有效量施用本發(fā)明化合物，其是SSAO的抑制劑。本發(fā)明化合物可以以每日一次的劑量或者按千克體重施用，并且可以以每日兩次、三次或四次的分份劑量施用總的每日劑量?？梢砸詡溥x的方式配制上述方面，S卩，以致本發(fā)明的一些實(shí)施方案提供VAP-I抑制劑作為抗纖維變性劑，用于預(yù)防、治療和/或緩解纖維變性疾病，例如肝纖維變性和誘發(fā)其的炎癥疾病，即急性和慢性肝炎、膽道疾病和中毒性肝損傷、肺纖維變性、腎纖維變性，包括糖尿病性腎病導(dǎo)致的腎纖維變性、骨髓纖維變性、胰纖維變性、硬皮病、結(jié)締組織疾病、瘢痕、皮膚纖維變性、心臟纖維變性、器官移植、血管狹窄、再狹窄、動(dòng)脈纖維變性、關(guān)節(jié)纖維變性(arthrofibrosis)、乳房纖維變性、肌肉纖維變性、腹膜后纖維變性、甲狀腺纖維變性、淋巴結(jié)纖維變性、膀胱纖維變性、胸膜纖維變性和C0PD，所述COPD是這樣的疾病，其中氣管壁隨肌成纖維細(xì)胞和膠原的積累而纖維變性，并且與所有纖維變性組織一樣，是收縮的。因此，可以將VAP-I抑制劑用于生產(chǎn)所述纖維變性疾病的藥物。術(shù)語(yǔ)“VAP-1抑制劑”指具有阻斷VAP-I的功能或其SSAO活性的能力的任意化合物?？梢詫AP-I抑制劑分成兩種主要種類(lèi)阻斷性抗體和SSAO抑制劑。如本文中所用，術(shù)語(yǔ)“抗VAP-I抗體”(Ab)或“單克隆VAP-I抗體”(MAb)意為包括能與VAP-I蛋白質(zhì)特異結(jié)合的完整抗體以及抗體片段，例如Fab和F(ab’)2片段。在本發(fā)明的多種方面中使用的合適的抗VAP-I抗體是本領(lǐng)域可得到的，并且可以通過(guò)技術(shù)人員已知的方法產(chǎn)生另外的抗體。例如，美國(guó)專(zhuān)利5，580，780描述了單克隆抗體(mAb)，1B2，其識(shí)別人VAP-I并可以在冰凍切片測(cè)定中阻斷淋巴細(xì)胞與扁桃體HEV結(jié)合。MAb1B2是鼠IgM-抗體，并且對(duì)于人VAP-I是特異的。國(guó)際專(zhuān)利公開(kāi)WO 03/093319公開(kāi)了嵌合的抗VAP-I單克隆抗體BTT-1002，其與對(duì)應(yīng)的鼠抗體比較，具有降低的免疫原性。然而，作為嵌合抗體，將其應(yīng)用于人類(lèi)治療受到損害，這歸因于其免疫原性以及由此產(chǎn)生的針對(duì)其的抗體。在此處引用作為參考的國(guó)際專(zhuān)利公開(kāi)WO 2008/129124公開(kāi)了具有降低的免疫原性和細(xì)胞因子釋放的完全人類(lèi)抗VAP-I抗體。優(yōu)選的完全人類(lèi)單克隆抗VAP-I抗體的實(shí)例包括這樣的抗體，其具有包含選自SEQ ID NO I-3的1-3個(gè)⑶R共有序列的重鏈多肽和/或 包含選自SEQ ID NO 24-26的1_3個(gè)⑶R共有序列的輕鏈多肽。其他優(yōu)選的抗VAP-I抗體包括這樣的抗體，其具有包含選自SEQ ID NO 4-8的第一⑶R序列、選自SEQ IDNO 9_13的第二⑶R序列和選自SEQ ID NO 14-18的第三⑶R序列的重鏈多肽和/或包含選自SEQ IDNO 27-31 的第一 CDR序列、選自 SEQ IDNO 32-36 的第二 CDR序列和選自 SEQ ID NO 37-41的第三⑶R序列的輕鏈多肽。在本發(fā)明的其他實(shí)施方案中，完全人類(lèi)抗VAP-I抗體是表示為8C10的抗體，并包含SEQ ID NO 19中所述的重鏈可變區(qū)和SEQ ID NO 42中所述的輕鏈可變區(qū)。還在其他實(shí)施方案中，抗VAP-I抗體是表示為8A4的抗體，并且其包含SEQ ID NO 20中所述的重鏈可變區(qū)和SEQ ID NO 43中所述的輕鏈可變區(qū)。在另外的實(shí)施方案中，抗VAP-I抗體是表示為3F10的抗體，并包含SEQ ID NO 21中所述的重鏈可變區(qū)和SEQ ID NO 44中所述的輕鏈可變區(qū)。又在另外的實(shí)施方案中，抗VAP-I抗體是表示為5F12的抗體，并包含SEQ ID NO 22中所述的重鏈可變區(qū)和SEQ ID NO 45中所述的輕鏈可變區(qū)。甚至又在另外的實(shí)施方案中，抗VAP-I抗體是表示為4B3的抗體，并包含SEQ ID NO 23中所述的重鏈可變區(qū)和SEQ ID NO46中所述的輕鏈可變區(qū)。還可以將這些抗體提供為重組抗體，例如重組r8C10(BTT-1023)，其包含SEQ ID NO 47中所述的重鏈多肽和SEQ ID N048中所述的輕鏈多肽。用于本發(fā)明實(shí)施方案的合適的SSAO抑制劑的實(shí)例包括但不限于，肼衍生物例如烯丙基肼類(lèi)，特別是苯基烯丙基肼類(lèi)；和羥胺(即氨氧基)衍生物。烯丙基肼類(lèi)的更特定的實(shí)例包括但不限于，2-(苯基-烯丙基)-餅、N-[2- (4’ _氟苯基)-烯丙基]-餅和(E)-I-氟-2-苯基-3-肼基丙烯，而羥胺衍生物的更特定的實(shí)例包括但不限于，2-氨氧基-I-苯基-乙醇和2_氛氧基-I-(3’，4’-二甲氧基-苯基)-乙醇。此類(lèi)SSAO抑制劑描述于TO2006/094201 和 W02005/014530 中，所述W02006/094201 和 W02005/014530 在此處引用作為參考。其他合適的肼衍生物包括乙酰肼類(lèi)，例如但不限于描述于此處引用作為參考的WO 2009/145360中的2-(4-{2-[5-(4-乙酰哌嗪-1-yl)批啶_2_基]乙基}苯基)乙酰肼；和肼醇類(lèi)，例如但不限于描述于此處引用作為參考的WO 02/02090中的(lR，2S)-2-(l-甲基肼基)-1_苯基-I-丙醇、(lR，2S)-2-(l-甲基肼基)-l，2-二苯基乙醇、1-(1’ -甲基肼基)-3-(間甲氧基苯氧基)-2-丙醇和(lS，2R)-2-(l-甲基肼基)-1，2-二苯基乙醇(BTT-2079);和肼茚滿(mǎn)類(lèi)，例如但不限于描述于在此處引用作為參考的WO 03/006003和W02005/080319 中的(IS, 2S)-2-(1-甲基肼基)-I-茚滿(mǎn)醇。用于本發(fā)明實(shí)施方案的合適的SSAO抑制劑的其他實(shí)例包括但不限于，丙烯基-和炔丙基胺、4-取代的-2-丁炔基胺、齒代烯丙基胺(特別地2-和3-齒代烯丙基胺)、批咯啉衍生物、炔丙基二胺、烯丙基胺和二胺。以上SSAO抑制劑的更特定實(shí)例包括但不限于5-苯氧基戍_2，3- 二烯基胺、4-(4-甲氧基苯基)丁 -3-炔基胺、4-苯基丁 -3-炔基胺、2-苯基_3_氟烯丙基胺、S- (E) -4- (4-氨基-2-氟代丁 -2-烯基氧基)-N-(I-苯乙基)苯甲酰胺、(E) -3-氟-4- (4-(甲基磺?；?苯氧基)丁 -2-烯-I-胺、(E) -3-氟-4- (2-甲基苯并[d]噻唑-5-基氧基)丁 -2-烯-I-胺、(E) -4- (4-氨基-2-氟代丁 -2-烯基氧基)-N- (I-苯乙基)苯磺酰胺和(E)-2-(4-氟代苯乙基)-3-氟代烯丙基胺(BTT-2089、mofegeline)。此類(lèi)化合物描述于 WO 2007/005737、WO 2005/082343、WO 2009/066152、WO 2009/055002 和Palfreyman等人，J Neural Transm. (1994), 41,407-414)中，所述文獻(xiàn)在此處引用作為參考。
用于本發(fā)明實(shí)施方案的合適的SSAO抑制劑的其他實(shí)例包括但不限于，描述于在此處引用作為參考的W02006/013209和US2007/066646中的4，5，6，7-四氫咪唑并[4, 5-c]吡啶衍生物(在WO 02/38153中所述，在此處引用作為參考)、羧酰胺例如N-羥基-2-(2-(2-甲基-IH-吲哚-3-基)乙酰胺基)乙酰胺和5-氨基-2-羥基-N-(2-羥基芐基)苯甲酰胺和磺酰胺例如N2-{ [4-(1，I-二甲基丙基)苯基]磺?；鶀-NI-羥基絲氨酰胺。此外，噻唑和/或胍衍生物，特別地2-?；被蜓苌镞m合于在本發(fā)明的多種實(shí)施方案中使用。此類(lèi)SSAO抑制劑的更特定實(shí)例包括但不限于N-{4-[2-(4-{[氨基(亞氨基)甲基]氨基}苯基)乙基]-I，3-三唑-2-基}乙酰胺、N-{4-[2-(4-{[氨基(亞氨基)甲基]氨基}苯基)乙基]_5-[4-(甲基磺?；?芐基]-1，3-三唑-2-基}乙酰胺、N-{4-[2-(4-{[2-氨基-IH-咪唑-4-基)甲基]苯基}乙基)三唑_2_基]-乙酰胺、
2-(4-{2-[2-(乙?；被?1，3-三唑-4-基]乙基}苯基)-N-[氨基(亞氨基)甲基]乙酰胺。此類(lèi)化合物描述于 W02004/087138、W02004/067521、W02006/028269、W02006/011631和W02005/089755中，所述全部文獻(xiàn)在此處弓I用作為參考。此外，多種肟衍生物是SSAO抑制劑，并可以因此用于本發(fā)明的多種實(shí)施方案。此類(lèi)肟衍生物包括但不限于，描述于WO 2010/029379中的5-溴-1，3-苯并二間二氧雜環(huán)戊烯-4-甲酰基咪唑肟、6-乙氧基-1，3- 二甲基-2，4- 二氧代-1，2，3，4-四氫嘧啶-5-甲酰基咪唑肟、1，3-二甲基-6-(甲硫基)_2，4-二氧代-1，2，3，4-四氫嘧啶-5-甲?；溥螂?，所述WO 2010/029379在此處引用作為參考。還可以將在WO 2010/015870,WO 2005/072738,Lyles G. A. ,Int. J. Biochem. CellBiol.第 28卷第 259-276 頁(yè)(1996)和McDonald等人,Annual reports in Med. Chem.第 42卷第229-243頁(yè)(2007)中公開(kāi)的二肼、芳烷基胺、T惡唑烷酮、鹵代烷基胺和苯磷硫胺(維生素BI)作為SSAO抑制劑用于本發(fā)明的多種實(shí)施方案，所述文獻(xiàn)在此處引用作為參考。適合在本發(fā)明實(shí)施方案的多個(gè)方面和實(shí)施方案中使用的其他SSAO抑制劑包括在此處引用作為參考的WO 2010/064020中描述的咪唑并吡啶衍生物。此外，在本發(fā)明的多種實(shí)施方案中使用的合適的SSAO抑制劑包括具有抑制或阻斷VAP-I的SSAO活性能力的任一立體異構(gòu)體、立體異構(gòu)體的混合物、E或Z形式、E或Z形式的混合物、前體藥物、代謝物、晶體形式、非晶體形式、水合物、溶劑合物或其鹽?？梢杂帽绢I(lǐng)域已知的SSAO測(cè)定法篩選并鑒定其他合適的SSAO抑制劑。該測(cè)定法包括VAP-1SSA0活性測(cè)定法，其使用基本上如用于單胺氧化酶和相關(guān)酶所述的偶聯(lián)比色方法(Holt, A.,等人，Anal. Biochem. 244 :384-392 (1997))。還可以使用 Amplex Red 試劑(10-乙酰基-3，7- 二羥基吩 惡嗪)，對(duì)H202高度敏感的和穩(wěn)定的探針，獨(dú)立地測(cè)量?jī)?nèi)皮細(xì)胞的 SSAO 活性(Zhou M, Panchuk-Voloshina N. Anal Biochem. 253 (2) : 169-74 (1997))。此外，可以使用[7-14C]-芐胺鹽酸鹽作為底物，通過(guò)放射化學(xué)方法測(cè)定胺氧化酶活性(Jaakkola 等人，Am J Pathol :155(6) : 1953-65 (1999))。作為 VAP-1SSA0 酶的來(lái)源，可以使用在細(xì)胞系例如中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢(CHO)細(xì)胞中表達(dá)的重組人類(lèi)VAP-lSSAO(Smith，D.J.，等人，J. Exp. Med. 188 :17-27 (1998))。其他合適的SSAO VAP-1酶來(lái)源可以是來(lái)自不同物種例如靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物和嚙齒動(dòng)物的血清和組織樣品。對(duì)于根據(jù)本發(fā)明實(shí)施方案的用途，可以將VAP-I抑制劑提供為藥物組合物，其包含可藥用載體或稀釋劑，以及作為活性成分的VAP-I抑制劑。組合物含有足以(完全地或部分地)拮抗需要此種拮抗的患者中患者的SSAO活性或者與VAP-I的生物學(xué)配體的天然VAP-I結(jié)合的量的VAP-I抑制劑?？梢酝ㄟ^(guò)治療纖維變性相關(guān)疾病的臨床領(lǐng)域的普通技術(shù)人員容易地確定VAP-I抑制劑的施用量和方案。一般地，VAP-I抑制劑治療的劑量是變化的，這取決于所考慮的事項(xiàng)，例如待治療患者的年齡、性別和一般健康狀況；若存在的話(huà)，冋時(shí)治療的種類(lèi)；治療的頻率和想要的效果的性質(zhì)；組織損傷的程度；癥狀的持續(xù)時(shí)間；以及可由各個(gè)醫(yī)師調(diào)整的其他變量?？梢砸砸淮位蚨啻螒?yīng)用施用想要的劑量，以獲得想要的結(jié)果?？梢砸詥挝粍┝啃问教峁└鶕?jù)本發(fā)明實(shí)施方案的藥物組合物。 可以在用于施用的任意合適藥物載體中施用藥物組合物。它們可以以任意形式使用，只要其實(shí)現(xiàn)預(yù)防、減輕、防止或者治愈人類(lèi)或動(dòng)物患者中纖維變性疾病的狀況。用于腸胃外和局部施用的藥物組合物包括無(wú)菌水性溶劑或非水性溶劑、混懸劑和乳劑。非水性溶劑的實(shí)例是丙二醇、聚乙二醇、植物油、魚(yú)油和可注射的有機(jī)酯。水性載體包括水、水-醇溶液，包括鹽水和緩沖的中等腸胃外運(yùn)載體，包括氯化鈉溶液、林格葡萄糖溶液、葡萄糖加氯化鈉溶液、含乳糖的林格溶液或不揮發(fā)的油。靜脈內(nèi)運(yùn)載體包括流體和營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)充劑、電解質(zhì)補(bǔ)充劑，例如那些基于林格葡萄糖的電解質(zhì)補(bǔ)充劑等等。根據(jù)實(shí)施方案的含水組合物可以包含合適的緩沖劑，例如取決于靶向的PH范圍，包含磷酸、檸檬酸、乙酸、碳酸或甘氨酸的鈉和鉀緩沖液。氯化鈉作為張度調(diào)節(jié)劑的用途也是有用的。組合物可以包括其他賦形劑，例如穩(wěn)定劑或防腐劑。有用的穩(wěn)定劑包括表面活性劑(聚山梨醇酯20 & 80、泊洛沙姆407)、聚合物(聚乙二醇、聚維酮)、碳水化合物(蔗糖、甘露醇、葡萄糖、乳糖)、醇(山梨醇、甘油、丙二醇、乙二醇)、合適的蛋白質(zhì)(白蛋白)、合適的氨基酸(甘氨酸、谷氨酸)、脂肪酸(乙醇胺)、抗氧化劑(抗壞血酸、半胱氨酸等)、螯合劑(EDTA鹽、組氨酸、天冬氨酸)或金屬離子(Ca、Ni、Mg、Mn)。其中有用的防腐劑是苯甲醇、氯代丁醇、苯扎氯銨和可能地對(duì)羥基苯甲酸酯?？梢砸詽饪s形式或者以根據(jù)需要重構(gòu)的粉末形式提供藥物組合物。在此類(lèi)情況下，可以將粉末制劑用于上述注射/輸注賦形劑的溶液。在凍干的情況下，優(yōu)選的是某些冷凍保護(hù)劑，包括聚合物(聚維酮、聚乙二醇、葡聚糖)、糖(蔗糖、葡萄糖、乳糖)、氨基酸(甘氨酸、精氨酸、谷氨酸)和白蛋白。如果將用于重構(gòu)的溶液加入到包裝中，其可以由例如，用于注射的純水或者氯化鈉溶液或者葡聚糖或葡萄糖溶液組成?？梢酝ㄟ^(guò)化學(xué)或者通過(guò)基因工程方法，將治療上有用的抗VAP-I抗體與其他試劑綴合，所述其他試劑提供抗體靶向期望的作用位點(diǎn)。備選地，可以通過(guò)化學(xué)或者通過(guò)基因工程方法，將其他化合物與抗體綴合，以增強(qiáng)或者提供抗體的其他特性，特別是增強(qiáng)抗體促進(jìn)由VAP-I結(jié)合介導(dǎo)的有害作用的減輕的能力。
可以通過(guò)化學(xué)或者通過(guò)基因工程方法標(biāo)記抗VAP-I抗體，以提供可檢測(cè)的抗體。此類(lèi)標(biāo)記的抗體對(duì)于在人類(lèi)中成像纖維變性位點(diǎn)，特別是對(duì)于在體內(nèi)免疫閃爍(immunoscintigraphic)成像纖維變性位點(diǎn)是有用的工具。對(duì)于成像目的，抗體片段的用途可能要優(yōu)于抗纖維變性治療的完整抗體方法，并且衍生自完全人類(lèi)抗體的片段應(yīng)當(dāng)比其嵌合等同物或小鼠等同物更安全。本發(fā)明的一些方面涉及診斷纖維變性疾病。關(guān)于本發(fā)明，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)體液(例如血清或血漿)中升高水平的可溶性VAP-1 (sVAP-1)和因此升高的SSAO活性與纖維變性的程度相關(guān)。因此，本發(fā)明的一些實(shí)施方案提供了用于診斷纖維變性疾病的工具和方法，所述纖維變性疾病為例如肝纖維變性和誘發(fā)其的炎癥疾病，即急性和慢性肝炎、膽道疾病和中毒性肝損傷、肺纖維變性、腎纖維變性，包括糖尿病性腎病導(dǎo)致的腎纖維變性、骨髓纖維變性、胰纖維變性、硬皮病、結(jié)締組織疾病、瘢痕、皮膚纖維變性、心臟纖維變性、器官移植、血管狹窄、再狹窄、動(dòng)脈纖維變性、關(guān)節(jié)纖維變性(arthrofibrosis)、乳房纖維變性、肌肉纖維變性、腹膜后纖維變性、甲狀腺纖維變性、淋巴結(jié)纖維變性、膀胱纖維變性、胸膜纖維變性和C0PD，所述COPD是這樣的疾病，其中氣管壁隨肌成纖維細(xì)胞和膠原的積累而纖維變性，并且與所有纖維變性組織一樣，是收縮的。在一些實(shí)施方案中，基于體液中升高的sVAP-1水平和/或SSAO活性的纖維變性疾病的診斷可以與纖維變性疾病現(xiàn)存的幾組預(yù)測(cè)性生物標(biāo)志物的分析組合。這可以改進(jìn)現(xiàn)存生物標(biāo)志物的診斷能力。換言之，可以單獨(dú)地或者與其他臨床和生物化學(xué)的標(biāo)志物組合使用sVAP-1水平/SSAO活性作為新的非侵入性測(cè)試，以預(yù)測(cè)纖維變性的存在?？梢酝ㄟ^(guò)以下方法測(cè)定體液樣品例如血清中sVAP-1的水平用于定量可溶性VAP-I 的時(shí)間分辨一步免疫突光測(cè)定法(time-resolved one-step immunofluorometricassay) (TR-IFMA) (DELFIA)使用生物素綴合的小鼠抗人VAP-I抗體TK8-14 (BiotieTherapies Corp.)作為鏈霉抗生物素蛋白包被的微量滴定板上的捕獲物。使用銪綴合的小鼠抗人VAP-I抗體TK8-18 (Biotie Therapies Corp.)作為示蹤物進(jìn)行結(jié)合的可溶性VAP-1的檢測(cè)。通過(guò)在615nm測(cè)量時(shí)間分辨熒光(Victorf多標(biāo)記計(jì)數(shù)器)檢測(cè)標(biāo)記。熒光計(jì)數(shù)與樣品中存在的可溶性VAP-I的多少直接相關(guān)。然后與參照的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)比較，分析樣品數(shù)據(jù)。在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，基于在獲自需要該診斷的和/或懷疑患纖維變性的受試者的體液中SSAO活性診斷纖維變性。用于該目的的一種合適方法已經(jīng)由Li等人在J. Chromatogr. B, 810 (2004) 277-282中公開(kāi)。測(cè)定SSAO活性的其他工具和方法是本領(lǐng)域已知的。此外，本發(fā)明的一些方面提供了用于診斷纖維變性的試劑盒。在一些實(shí)施方案中，試劑盒包含用于評(píng)估sVAP-1的量的一種或多種試劑，例如特異性抗VAP-I抗體，例如上述抗VAP-I抗體之一。在其他實(shí)施方案中，試劑盒包含用于評(píng)估在體液例如血清或血漿中SSAO活性的一種或多種試劑。例如，試劑盒可以包含VAP-1SSA0的底物，例如芐胺、甲胺、氨基丙酮或者其他脂肪族或芳族單胺，以及合適的SSAO酶活性測(cè)定緩沖液，以及用于測(cè)定SSAO活性的一套試劑和方法?？梢允褂门悸?lián)的測(cè)定法檢測(cè)SSAO活性，其中測(cè)量在單胺底物上由于SSAO活性的作用產(chǎn)生的過(guò)氧化氫，或者其可以通過(guò)使用14C標(biāo)記的胺底物例如芐胺，監(jiān)測(cè)水溶性胺至有機(jī)溶劑可溶性醛的轉(zhuǎn)變來(lái)直接測(cè)量。對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見(jiàn)的是，因?yàn)榧夹g(shù)進(jìn)步，可以以多種方式實(shí)施本發(fā)明概念。本發(fā)明及其實(shí)施方案并不受限于以下所描述的實(shí)施例，但可以在權(quán)利要求的范圍內(nèi)進(jìn)行改變。實(shí)施例I. VAP-I抑制劑在肝纖維變性的小鼠模型中的作用本研究的目的是在小鼠中評(píng)估VAP-I抑制劑對(duì)纖維變性肝損失的作用。
根據(jù)Home Off ice規(guī)范,在Birmingham大學(xué)的生物醫(yī)學(xué)服務(wù)單位,在常規(guī)條件下維持并飼養(yǎng)全部小鼠。每籠飼養(yǎng)4只小鼠，并在實(shí)驗(yàn)前使它們適應(yīng)飼養(yǎng)環(huán)境一周。在研究中使用8-10周齡的雌性C57BL/6和VAP-I-/-小鼠(缺少VAP-I的A0C3基因敲除小鼠)。C57BL/6小鼠獲自Birmingham大學(xué)的生物醫(yī)學(xué)服務(wù)單位的原種群體，而VAP-1-/-(A0C3基因敲除)小鼠獲自合同培養(yǎng)者Taconic，丹麥。通過(guò)以lml/kg的劑量，每?jī)芍芤淮胃鼓?nèi)施用溶解于礦物油中的四氯化碳(CC14 ；Aldrich Chemical) 8周，建立慢性肝纖維變性的小鼠模型，而對(duì)照組僅接受礦物油。在CC14施用之前和期間，用小鼠抗小鼠VAP-I抗體BTT-1029處理的小鼠接受每周一次的靜脈內(nèi)注射兩周。在CC14的最終劑量后96小時(shí)，處死動(dòng)物。通過(guò)在異氟烷麻醉期間的心臟穿刺抽取血液樣品，之后通過(guò)頸椎脫位處死小鼠。解剖肝臟并切成4塊用于不同的處理。使用SPSS for Windows 11. 0版進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)方差分析。將單向方差分析然后Fisher’ s 至少顯著差異事后檢驗(yàn)(Fisher’ s least significant difference post hoctest)用于分析具有兩個(gè)以上變量組的樣品的顯著性。將肝樣本固定在4%多聚甲醛中，包埋在石蠟中并切成4 y m切片。用于組織病理學(xué)分析的切片是根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)步驟染色的Sirus red (Sirius red)或者H&E。對(duì)于免疫突光染色，將固定的小鼠肝通過(guò)浸沒(méi)在30%蔗糖中、快速冷凍來(lái)進(jìn)行低溫保護(hù)，并在低溫恒溫器中切成7iim。簡(jiǎn)言之，用含0. l%Triton X-100 (PBST)的磷酸緩沖鹽水洗滌切片10分鐘，并用在0. P/oPBST中的10%山羊血清室溫溫育I小時(shí)。用在血清-PBST中稀釋的針對(duì)彈性蛋白、膠原蛋白IV和層粘連蛋白(Abcam)的一級(jí)抗體溫育后，將載玻片在PBST中洗滌三次并用二級(jí)抗體室溫溫育I小時(shí)。如所預(yù)期，CC14在C57BL/6小鼠中誘導(dǎo)了嚴(yán)重的纖維變性損傷。8周時(shí)，野生型小鼠顯示出Sirus red原纖維的肝臟含量8倍的增加,所述Sirus red原纖維具有肝細(xì)胞壞死和進(jìn)行性的肝炎。有趣地，在VAP-I缺陷型小鼠和BTT-1029處理的野生型小鼠二者中，纖維變性損傷顯著降低。這些小鼠僅表現(xiàn)出少量的Sirus red原纖維，并且肝臟組織學(xué)顯示幾乎正常(完全沒(méi)有壞死區(qū)域和僅輕微的肝炎)(圖I和2)。此外，存在顯著更少數(shù)量的成熟巨噬細(xì)胞，與野生型比較，再次顯示出較輕微的損傷(數(shù)據(jù)未顯示)。通過(guò)qRT-PCR評(píng)估肝中與肝星形細(xì)胞活化相關(guān)的基因的mRNA水平。為此，使用Qiagen RNAeasy Mini試劑盒(#74104)從小鼠肝中提取總RNA。使用隨機(jī)引物(Promega)和來(lái)自Invitrogen的Superscript III，將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA模板。qRT-PCR的參數(shù)如下變性95°C 10分鐘，55個(gè)循環(huán)的擴(kuò)增95°C 10秒，55°C 30秒，72°C I秒。使用參照基因GAPDH 和來(lái)自 Roche 的探針，用 Roche LightCycler480 系統(tǒng)測(cè)量 Quantitative Real-timePCR0使用“E-方法”(Roche)定量表達(dá)水平。數(shù)據(jù)顯示，VAP-I通過(guò)調(diào)節(jié)肝星形細(xì)胞(HSC)在肝纖維變性發(fā)展中起作用。認(rèn)為活化的HSC是纖維變性肝中合成ECM組分、包括彈性蛋白的主要來(lái)源。施用了 CC14的野生型肝顯示出a SMA和彈性蛋白mRNA水平的明顯增加，表明表達(dá)a SMA的HSC的積累和彈性蛋白的沉積(圖4)。與野生型肝比較，在BTT-1029處理的野生型和VAP-I-/-肝中，a SMA和彈性蛋白二者的mRNA水平顯著更低。彈性蛋白和膠原蛋白IV表達(dá)的差異還通過(guò)共聚焦顯微術(shù)證實(shí)，然而層粘連蛋白水平保持不變(圖3)?？傊?，BTT-1029處理通過(guò)降低肝星形細(xì)胞的活化，誘導(dǎo)了已建立的肝纖維變性的幾乎完全保護(hù)，因此限制了纖維變性病變中成纖維細(xì)胞的發(fā)展。在VAP-I-/-小鼠中也顯示出同樣的作用，表現(xiàn)出對(duì)CC14誘導(dǎo)的損傷的幾乎完全保護(hù)。結(jié)果顯示，VAP-I通過(guò)對(duì)肝星 形細(xì)胞的調(diào)節(jié)作用在肝纖維變性的發(fā)展中作為關(guān)鍵成員。VAP-1SSA0是銅胺氧化酶，并因此與賴(lài)氨酰氧化酶類(lèi)似，所述賴(lài)氨酰氧化酶是另一種銅胺氧化酶，負(fù)責(zé)交聯(lián)ECM蛋白質(zhì)例如彈性蛋白和膠原蛋白。仍可能的是，VAP-I的SSAO活性還對(duì)ECM蛋白質(zhì)中交聯(lián)的形成具有直接作用。此外,使用[7-14C]節(jié)胺鹽酸鹽(spec. act. 57mCi/mmol)作為底物通過(guò)放射化學(xué)方法測(cè)定血清和肝組織樣品的SSAO活性(圖5)。在37°C，用5 y M氯吉蘭和帕吉林，并用具有ImM氨基脲的非特異結(jié)合管預(yù)溫育血清(40mg/ml蛋白質(zhì))或組織制備物(2mg/ml蛋白質(zhì))30分鐘。在37°C，在終體積200 ill含[7-14C]芐胺鹽酸鹽作為底物的0. 2mM磷酸鈉緩沖液(pH 7.4)中進(jìn)行測(cè)定I小時(shí)。如之前在Jaakkola等人，1999 (American Journal ofPathology, 155,6)中所述終止并處理催化性酶活性反應(yīng)測(cè)定。使用牛血清白蛋白作為標(biāo)準(zhǔn)品，根據(jù) Bradford 等人(Bradford, M. M. , 1976, Anal. Biochem. 72, 248)測(cè)定蛋白質(zhì)濃度。結(jié)果顯示，除了防止了 CC14誘導(dǎo)的肝纖維變性外，BTT-1029處理還明顯降低了所述肝樣品中的SSAO活性。實(shí)施例2. VAP-I抑制劑在腎損傷的小鼠模型中的腎保護(hù)作用高暴露于四氯化碳對(duì)肝和腎均造成了傷害。因此收集來(lái)自在實(shí)施例I中所述的經(jīng)CC14處理動(dòng)物的腎，并分析VAP-I抑制劑對(duì)腎病的作用。將腎固定在4%多聚甲醛中，包埋在石蠟中并切成4iim切片。在Sirus red和H&E染色的切片上進(jìn)行組織病理學(xué)分析。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行染色。通過(guò)使用Image J軟件的閾值分析定量Sirus red原纖維的量。使用SPSS Windows，版本11. 0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)方差分析。將單向方差分析然后TukeyHSD，s 最小顯著差異事后檢驗(yàn)(Tukey HSD，s least significant difference post hoctest)用于分析具有兩個(gè)以上變量組的樣品中的顯著性。施用了 CC14的小鼠顯示出具有節(jié)段性和整體性改變的局部腎小球改變。H&E染色顯示出多種病變，例如腎小球系膜細(xì)胞過(guò)多、尖端區(qū)域的粘連和硬化。然而，主要觀(guān)察到了腎小球簇的整體崩解，并且僅留下了腎小球的片段(數(shù)據(jù)未顯示)。有趣地，VAP-I敲除小鼠和BTT-1029處理的小鼠完全沒(méi)有腎小球病變(圖6)。通過(guò)Sirus red染色，評(píng)估作為纖維變性的指征的腎小球周?chē)z原的積累。在C57BL/6小鼠中施用CC14，誘導(dǎo)了腎小球簇周?chē)z原積累的幾乎兩倍增加。有趣地，缺少VAP-I或者施用了 VAP-I抑制劑的小鼠與對(duì)照類(lèi)似，顯示出膠原沉積的顯著減少(圖7)。結(jié)果清楚顯示了 VAP-I在CC14誘導(dǎo)的腎病中的保護(hù)性作用。實(shí)施例3. VAP-I抑制劑在COPD小鼠模型中的作用應(yīng)用煙草煙誘導(dǎo)的COPD小鼠模型評(píng)估VAP-I抑制劑對(duì)COPD的治療的作用。將C57BL/6J小鼠每日一次暴露于煙草煙(TS) 11個(gè)連續(xù)日，在最后TS暴露后24小時(shí)，產(chǎn)生了肺部炎癥。11天后，應(yīng)答包括巨噬細(xì)胞、上皮細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、嗜中性粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞的顯著增加。將小鼠隨機(jī)分成研究組(n=10)，并在第-I天、第3天、第6天和第9天TS暴露后4 小時(shí)用運(yùn)載體(5ml/kg PBS pH 7.4+0. 1%多山醇酯80)或小鼠單克隆抗VAP-1抗體(3mg/kg或9mg/kg在運(yùn)載體中的BTT-1029)靜脈內(nèi)處理。另一組(n=10)靜脈內(nèi)接受運(yùn)載體,并暴露于空氣相同長(zhǎng)度的時(shí)間。另外兩組小鼠(n=10)在每次TS暴露前I小時(shí)每日一次口服地接受另一運(yùn)載體(在無(wú)菌水中的0. 5%的羧甲基纖維素鈉鹽(CMC))或參照化合物(在0. 5%CMC中的5mg/kg羅氟司特)。最后一組(n=10)接受口服運(yùn)載體(0. 5%CMC)，并暴露于空氣等同長(zhǎng)度的時(shí)間。將全部結(jié)果表示為每一動(dòng)物的各個(gè)時(shí)間點(diǎn)和每一組計(jì)算的平均值。如果正態(tài)檢驗(yàn)為陽(yáng)性，則首先將數(shù)據(jù)進(jìn)行單向方差分析(ANOVA)，然后是用于多重比較的Bonfeironi校正(Bonferroni correction for multiple comparison),以測(cè)試處理組之間的顯著性。認(rèn)為“P”值彡0. 05為統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著。將全部數(shù)據(jù)都進(jìn)行等方差性的Bartlets檢驗(yàn)，并對(duì)于大多數(shù)研究，方差一般是相等的，然而，如在本研究中發(fā)生，一些處理組偶爾會(huì)給出陽(yáng)性結(jié)果。因此，還使用非參數(shù)分析。由于數(shù)據(jù)是正態(tài)分布，引用參數(shù)分析(ANOVA)。使用以下公式，在Excel電子表格為細(xì)胞數(shù)據(jù)內(nèi)自動(dòng)計(jì)算抑制百分比
%抑制=1 . f 處理組結(jié)果-假手術(shù)組結(jié)果 )x 10Q\ TS運(yùn)載體組結(jié)果—假手術(shù)組結(jié)果，當(dāng)在研究的第-I天、第3天、第6天&第9天，在TS暴露后4小時(shí)以9mg/kg和3mg/kg靜脈內(nèi)給予BTT-1029時(shí)，在BAL中顯著降低了 TS誘導(dǎo)的細(xì)胞增加(分別38%和33%抑制，二者都p < 0. 001)(圖8)。這由巨噬細(xì)胞(分別29%和22%抑制，p < 0. 01&p< 0. 05)、嗜中性粒細(xì)胞(66%和59%抑制，二者都p < 0. 001)、淋巴細(xì)胞(69%和54%抑制，二者都P < 0. 001)和嗜酸性粒細(xì)胞(分別93%和65%抑制，p < 0. 001和p < 0. 01)的明顯降低組成。參照化合物羅氟司特，當(dāng)在TS暴露前I小時(shí)每日一次口服給予時(shí)，也顯著降低了細(xì)胞的總數(shù)(41%，p < 0. 001)(圖9)。這種抑制包含嗜中性粒細(xì)胞(63%，p < 0. 001)、上皮細(xì)胞(51%，p < 0. 01)和淋巴細(xì)胞(65%，p < 0. 001)的降低。在該研究中，羅氟司特并沒(méi)有顯著降低在BAL中發(fā)現(xiàn)的巨噬細(xì)胞和嗜酸性粒細(xì)胞的數(shù)量。實(shí)施例4. VAP-I抑制劑在血管壁中對(duì)新內(nèi)膜和血管中層纖維變性的作用
新內(nèi)膜和血管中層增厚是動(dòng)脈粥樣病變發(fā)展中的早期和重要階段，并且是再狹窄的基本組分。其伴隨著血管壁的新內(nèi)膜和血管中層的纖維變性改變。本研究通過(guò)在接受了中等西式飲食的ApoE3 Leiden小鼠的股動(dòng)脈中評(píng)價(jià)全身遞送(通過(guò)每日腹腔內(nèi)注射)小分子SSAO抑制劑(莫非吉蘭，BTT-2089)對(duì)套(cuff)誘導(dǎo)的新內(nèi)膜增厚(套誘導(dǎo)的狹窄)的作用，來(lái)評(píng)價(jià)阻斷SSAO在纖維變性疾病中的作用。方法在手術(shù)套放置前，用輕度高膽固醇血飲食喂飼40只雄性ApoE3*Leiden小鼠(12周齡)3周。處理為用I)運(yùn)載體；2)飲用水中9mg/l的地塞米松；3)每日腹膜內(nèi)注射10mg/kg的BTT-2089 ；4)每日腹膜內(nèi)注射30mg/kg的BTT-2089，都在手術(shù)前I天開(kāi)始，并在實(shí)驗(yàn)期間一直持續(xù)。在第0天進(jìn)行手術(shù)，即在小鼠的兩個(gè)股動(dòng)脈周?chē)挤胖昧朔鞘湛s性套(2-3mm長(zhǎng))。兩周后處死每組的10只小鼠用于組織形態(tài)學(xué)測(cè)量分析，以定量加速的動(dòng)脈粥樣硬化病變和新內(nèi)膜形成的抑制。與NaCl 0. 9%處理的對(duì)照組比較，在地塞米松處理的陽(yáng)性對(duì)照組中觀(guān)察到了血管中層和新內(nèi)膜形成的顯著降低(圖10和11)。這反映為當(dāng)與對(duì)照組比較時(shí)，在SSAO抑制劑處理組中HPS染色的血管區(qū)段的實(shí)例中增加的管腔大小(圖12)。在相同的模型中，用來(lái)自與BTT-2089不同的化學(xué)種類(lèi)的另一 SSAO抑制劑進(jìn)行第 二次研究。通過(guò)每日腹膜內(nèi)注射，以10mg/kg的水平給予這種基于肼的抑制劑(BTT-2079)，并與30mg/kg的BTT-2089比較。除省略了地塞米松對(duì)照組外，在全部其他方面，本研究以相同的方式進(jìn)行。以每日腹膜內(nèi)30mg/kg莫非吉非(BTT-2089)抑制SSAO也具有有利的作用，并顯示出SSAO抑制后新內(nèi)膜形成和管腔狹窄百分比的顯著降低。用每日腹膜內(nèi)IOmg/kg的SSAO抑制劑BTT-2079處理的組也導(dǎo)致了新內(nèi)膜形成的顯著降低。在全部組之間沒(méi)有發(fā)現(xiàn)血管壁直徑、血管中層和管腔面積的顯著改變。10mg/kg的BTT-2079和30mg/kg的BTT-2089的內(nèi)膜血管中層比率與對(duì)照組比較顯著更低，但與對(duì)照組比較，管腔狹窄百分比僅在30mg/kg的BTT-2089組中顯著更低。血管完整性未受影響。這些研究表明，當(dāng)與對(duì)照處理組比較時(shí)，系統(tǒng)性施用SSAO抑制劑在A(yíng)poE 3Leiden小鼠套模型中導(dǎo)致了較少的新內(nèi)膜增厚(新內(nèi)膜纖維變性)。實(shí)施例5. VAP-I抑制劑在肺纖維變性的小鼠模型中的作用建立了博來(lái)霉素誘導(dǎo)的肺纖維變性，并將可繁殖的小鼠模型用于研究肺纖維變性。通過(guò)Alzet微型滲透泵，用博來(lái)霉素(100mg/kg)全身性處理8周齡的雄性C57BL/6J小鼠7天，以誘發(fā)肺損傷。在泵植入后7-21天，沒(méi)有觀(guān)察到肺毒性。在第21天，如通過(guò)組織病理學(xué)評(píng)價(jià)，在肺中存在12-15%的纖維變性。這隨后是臨床性肺損傷，其可以通過(guò)增加的呼吸頻率和體重的明顯降低觀(guān)察到，并最終導(dǎo)致在42天內(nèi)(如果沒(méi)有提前處死)死亡。將小鼠隨機(jī)分成研究組，并通過(guò)從第0天至第28天每三天一次靜脈內(nèi)注射用運(yùn)載體、VAP-I抑制劑或參照化合物處理。在第21天，將每一研究組的一半小鼠處死，而在第28天處死另一半。在尸體解剖時(shí)，固定(10%中性緩沖福爾馬林)肺，并進(jìn)行組織病理學(xué)處理，用于分級(jí)纖維變性病變。用H&E和Masson’s Trichrome染色組織切片，以鑒定纖維變性。用計(jì)算機(jī)輔助的圖像分析定量每一只小鼠纖維變性肺面積與總肺面積的比率。將單向方差分析然后合適的事后檢驗(yàn)用于具有兩個(gè)以上變量組的樣品中顯著性的分析。如通過(guò)與對(duì)照比較，評(píng)分的統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著降低所證明，可以顯示出肺纖維變性的降低。實(shí)施例6. VAP-I抑制劑在糖尿病腎疾病的小鼠模型中的腎保護(hù)作用糖尿病可以引起與漸進(jìn)性腎纖維變性相關(guān)的糖尿病腎病(DN)，最終降低功能性腎質(zhì)量。為了評(píng)估抗VAP-I抗體和SSAO抑制劑對(duì)腎纖維變性的作用，應(yīng)用糖尿病腎疾病的已建立的Db/db糖尿病小鼠模型。
大體上根據(jù)Guide for the Care and Use of Laboratory Animals (NationalAcademy Press, Washington, D. C. , 1996)進(jìn)行這些實(shí)驗(yàn)的全部方面(飼養(yǎng)、實(shí)驗(yàn)和動(dòng)物的處理)。評(píng)價(jià)測(cè)試品(SSA0抑制劑BTT-2079)在糖尿病腎病的小鼠模型中可能的腎保護(hù)作用。當(dāng)完全建立了糖尿病時(shí)，將測(cè)試物質(zhì)和運(yùn)載體每日一次腹膜內(nèi)(IP)施用給15周齡的db/db小鼠(BKS Cg-Lepr db/Lepr db) 42個(gè)連續(xù)日。將Db/m小鼠用作為瘦正常對(duì)照(leannormal control)。與db/m小鼠比較，db/db小鼠顯示出升高的血衆(zhòng)肌酸酐(表明受損的腎功能)，以及高血糖和血脂異常(LDL、總膽固醇和甘油三酯)。糖尿病小鼠與肥胖、多尿、蛋白尿和增加的分次尿鈉排泄(fractional urinary Na+ excretion) (FENa)有關(guān),表明受損的腎小管Na+再吸收。一種腎小球?yàn)V過(guò)率的估計(jì)一內(nèi)源肌酸酐清除(CCr)在糖尿病小鼠中比db/m小鼠中更低。如下所述，將雄性db/db非胰島素依賴(lài)的糖尿病小鼠分配到處理組。表I.實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的概述
細(xì) ## 徹____(mg/kg)__(雄性)Idb/m適載體08I__db/db 運(yùn)載體__0__83__db/db BTT-2079__S__84db/db BTT-2079 I 15 I 8db/m:非糖暴病的瘦雜合子db/db: BKS Cg-Lepr _/Lepr _小鼠；非胰島素依賴(lài)讀耱暴病通過(guò)腹膜_隹身施用全部運(yùn)載體和酬誡晶6在生命期結(jié)束時(shí)，進(jìn)行尸體解剖，包括收集并保存組織。將來(lái)自全部32只動(dòng)物的右腎固定在10%中性緩沖的福爾馬林中。修剪縱切面并加工成石蠟塊，切片成3微米，并用高碘酸席夫(PAS)染色，通過(guò)光學(xué)顯微鏡評(píng)價(jià)。根據(jù)在以下方法中所述的半定量評(píng)分方案，在每個(gè)腎的50個(gè)腎小球中對(duì)腎小球膜基質(zhì)擴(kuò)張(mesangial matrix expansion)打分。
根據(jù)以下系統(tǒng)評(píng)分來(lái)自每一個(gè)腎的50個(gè)腎小球的腎小球膜基質(zhì)擴(kuò)張。
最低的等級(jí)1，基質(zhì)占據(jù)了 0-25%的腎小球體積 輕微的等級(jí)2，基質(zhì)占據(jù)了 25-50%的腎小球體積 中度的等級(jí)3，基質(zhì)占據(jù)了 50-75%的腎小球體積 重度的等級(jí)4，基質(zhì)占據(jù)了 75-100%的腎小球體積通過(guò)合計(jì)每組中全部動(dòng)物的腎小球膜基質(zhì)得分并除以組中動(dòng)物的總數(shù)的總和，得出每組的平均腎小球膜基質(zhì)擴(kuò)張得分。組均腎小球膜基質(zhì)擴(kuò)張得分顯示于下表中。表2.組均腎小球膜基質(zhì)擴(kuò)張得分 Ial~r^El組均腎小球膜基質(zhì)擴(kuò)張得分
~運(yùn)載體5476
—I運(yùn)載體%75
5BTT-2079,5mg/kg82 4
~6BTT-2079,15mg/kg65 4在正常動(dòng)物中可以看到極少的腎小球膜基質(zhì)，但腎小球膜基質(zhì)的擴(kuò)張是多種疾病例如糖尿病的特征。腎小球膜基質(zhì)包括基底膜和相關(guān)的多陰離子蛋白聚糖，以及其他用高碘酸席夫(PAS)方法染色成紅色至紫色的分子。因此，腎小球中PAS陽(yáng)性物質(zhì)的量是對(duì)存在的腎小球膜基質(zhì)的量的度量。以200 X放大倍數(shù)評(píng)價(jià)來(lái)自每一動(dòng)物的50個(gè)腎小球，并使用上述評(píng)分系統(tǒng)為擴(kuò)張的腎小球膜基質(zhì)打分。通過(guò)合計(jì)對(duì)每一動(dòng)物評(píng)價(jià)的每一腎小球的評(píng)分，計(jì)算組均腎小球膜基質(zhì)擴(kuò)張得分。然后合計(jì)組中全部動(dòng)物的腎小球膜基質(zhì)擴(kuò)張得分并除以每組動(dòng)物的數(shù)量，以獲得組均腎小球膜基質(zhì)擴(kuò)張得分。基于這些數(shù)據(jù)，相對(duì)于db/db非胰島素依賴(lài)的糖尿病小鼠(組2)中的組均腎小球膜基質(zhì)擴(kuò)張得分，用5mg/kg和15mg/kg的BTT-2079的治療以劑量相關(guān)的方式降低了腎小球膜基質(zhì)擴(kuò)張得分。為了評(píng)估抗VAP-I抗體和SSAO抑制劑對(duì)腎纖維變性的作用，應(yīng)用了用于糖尿病腎病的其他成熟的小鼠模型I)鏈脲菌素誘導(dǎo)的糖尿病小鼠模型2)單側(cè)輸尿管梗阻，腎纖維變性模型。I)鏈脲菌素誘導(dǎo)的糖尿病小鼠模型。在鏈脲菌素(STZ)注射前6h禁食6-7周齡(體重20-25g)的雄性小鼠。為了誘導(dǎo)糖尿病，將新鮮混合的STZ(檸檬酸鈉緩沖液中的7mg/ml)以55mg/kg腹膜內(nèi)注射到每一預(yù)先饑餓的小鼠中。為了完成該疾病的誘導(dǎo)，重復(fù)該步驟，以使每一小鼠連續(xù)5天都接受一次STZ注射。最后的STZ注射后一周，將未禁食血糖低于280mg/dL的小鼠排除于實(shí)驗(yàn)之外，因?yàn)檫@些小鼠通常不會(huì)發(fā)展成足以造成顯著腎損傷的糖尿病。用合適體積的運(yùn)載體或測(cè)試物質(zhì)，每隔一天腹膜內(nèi)給藥全部小鼠連續(xù)3周。全部動(dòng)物都隨意地給予正常的實(shí)驗(yàn)室食物和水。通過(guò)酶學(xué)方法(Mutarotase-GOD)測(cè)定血液樣品的血清化學(xué)物水平。通過(guò)測(cè)量尿白蛋白分泌和肌酸酐清除通過(guò)生物化學(xué)方法評(píng)估腎損傷，并另外地通過(guò)Masson三色染色和高碘酸席夫染色通過(guò)組織學(xué)方法評(píng)估腎損傷。2)單側(cè)輸尿管梗阻-腎纖維變性模型。在手術(shù)前5天和手術(shù)后7天，用運(yùn)載體或測(cè)試物質(zhì)腹膜內(nèi)給藥全部小鼠。以合適的量每隔一天注射抑制劑和運(yùn)載體，以抑制SSA0。全部動(dòng)物都隨意地給予正常的實(shí)驗(yàn)室食物和水。、
用異氟燒(2-氯_2_ ( 二氟甲氧基)-I, I, I- 二氟-乙燒)吸入麻醉6_7周齡(體重20-25g)的雄性小鼠，并在手術(shù)前皮下注射0，05-0, lmg/kg 丁丙諾啡。將小鼠進(jìn)行單側(cè)輸尿管梗阻(UUO)或假手術(shù)。在UUO手術(shù)小鼠中，用4-0絲縫線(xiàn)在兩點(diǎn)結(jié)扎左輸尿管并在結(jié)扎線(xiàn)之間切斷，以預(yù)防逆行的泌尿道感染。手術(shù)后7天處死小鼠。通過(guò)測(cè)量尿白蛋白分泌和肌酸酐清除通過(guò)生物化學(xué)方法評(píng)估腎損傷，并另外地通過(guò)Masson三色染色和高碘酸席夫染色通過(guò)組織學(xué)方法評(píng)估腎損傷。將單向方差分析和Dunnett’ s檢驗(yàn)用于全部研究，以確定處理組和運(yùn)載體組之間的顯著性差異。*P< 0.05時(shí)認(rèn)為差異顯著。如通過(guò)與對(duì)照比較評(píng)分的顯著降低，可以顯示出腎纖維變性的降低。實(shí)施例7.糖尿病腎病的抗纖維變性治療糖尿病腎病是晚期腎病和纖維變性的常見(jiàn)原因，特別是間質(zhì)纖維變性是糖尿病腎病的主要病理學(xué)特征。臨床研究可以測(cè)定VAP-I的抑制劑是否可以減輕患糖尿病的患者的腎病，以延長(zhǎng)腎功能。將具有20-75ml/分鐘/I. 73m2之間的腎小球?yàn)V過(guò)率(GFR)、大于300mg/天的蛋白尿和血壓低于或等于140/90的，正在使用血管緊張素轉(zhuǎn)化酶(ACE)或血管緊張素受體拮抗劑(ARA)的患I型和2型糖尿病的成年患者招募入研究中。在合適的劑量方案(每日一次或者更少)的情況下，使患者接受有效水平的VAP-I抑制劑或者安慰劑I年。將患者隨機(jī)分配成安慰劑組或者VAP-I抑制劑組。在研究期間，定期監(jiān)測(cè)患者的參數(shù)，例如空腹血液和尿液葡萄糖水平、血壓和臨床化學(xué)?？梢猿槿×硗獾难簶悠芬詼y(cè)量血清VAP-1SSA0的水平，其可能在糖尿病中升高并與該疾病的進(jìn)程相關(guān)。此外，可以評(píng)價(jià)血清樣品中的甲胺水平。升高的甲胺是抑制VAP-1SSA0活性的生物標(biāo)志物。要求患者在家定期檢查他們的血壓和血糖并記錄獲得的值，以監(jiān)測(cè)他們的糖尿病狀態(tài)。通過(guò)以合適的量施用胰島素，可以以此方式較好的控制患者的糖尿病。按當(dāng)前治療糖尿病腎病的標(biāo)準(zhǔn)可以維持患者，所述當(dāng)前治療糖尿病腎病的標(biāo)準(zhǔn)可以包括用ACE抑制劑和/或ARA治療、血壓目標(biāo)低于130/80的抗高血壓治療和適當(dāng)?shù)卦O(shè)定HbAlC的目標(biāo)的嚴(yán)格血糖過(guò)多控制。通過(guò)GFR評(píng)估腎功能，并且研究的初級(jí)終點(diǎn)可以是腎功能從研究期的基線(xiàn)至終點(diǎn)的改變。次級(jí)終點(diǎn)可以包括尿白蛋白分泌在研究期的改變百分比。實(shí)施例8. VAP-I作為纖維變性疾病的診斷標(biāo)志物本文通過(guò)免疫組織化學(xué)顯示，肝VAP-I表達(dá)在具有非常高水平的纖維變性隔(septa)的肝硬化中是增加的(圖13-15)。多色共聚焦顯微鏡顯示，在肝星形細(xì)胞和肝肌成纖維細(xì)胞上VAP-I的表達(dá)(圖16)。將培養(yǎng)的人肝星形細(xì)胞(HSC)用于確認(rèn)HSC在體外表達(dá)和分泌sVAP-1。這些結(jié)果提示了 VAP-I在纖維發(fā)生中的可能作用。在明確定義的一組患非酒精性脂肪肝疾病(NAFLD)(具有匹配的和分級(jí)的肝組織學(xué)(Kleiner分類(lèi)))的138名患者中測(cè)量血清sVAP_l水平。相對(duì)于肝組織學(xué)(脂肪變性、炎癥和纖維變性)、代謝參數(shù)和肝損傷的血清學(xué)標(biāo)志物，評(píng)估sVAP-1水平(表3)。表3.在具有組織學(xué)分級(jí)和分期的NAFLD的138名患者中測(cè)量的人口統(tǒng)計(jì)學(xué)數(shù)據(jù)和參數(shù)的總結(jié)

權(quán)利要求
1.作為抗纖維變性劑的VAP-I抑制劑。
2.權(quán)利要求I的VAP-I抑制劑，其選自單克隆抗VAP-I抗體和SSAO抑制劑。
3.權(quán)利要求2的VAP-I抑制劑，其中所述抗體是包含選自SEQID NO I-3的1_3個(gè)⑶R共有序列的完全人類(lèi)抗VAP-I抗體和/或包含選自SEQID NO 24-26的1_3個(gè)⑶R共有序列的輕鏈多肽。
4.權(quán)利要求2的VAP-I抑制劑，其中所述抗體具有包含選自SEQIDNO 4_8的第一⑶R序列、選自SEQ ID NO 9-13的第二⑶R序列和選自SEQ ID N014-18的第三⑶R序列的重鏈多肽和/或包含選自SEQ ID N027-31的第一 CDR序列、選自SEQ ID NO 32-36的第二 CDR序列和選自SEQ ID NO 37-41的第三⑶R序列的輕鏈多肽。
5.根據(jù)權(quán)利要求4的VAP-I抑制劑，其中所述抗體具有包含選自SEQIDNO 19-23的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)和包含選自SEQ ID NO 42-46的氨基酸序列的各個(gè)輕鏈可變區(qū)。
6.權(quán)利要求2的VAP-I抑制劑，其中所述抗體是包含SEQID NO 47中所述的重鏈多肽和SEQ ID NO 48中所述的輕鏈多肽的完全人類(lèi)重組抗體。
7.權(quán)利要求2的VAP-I抑制劑，其中所述SSAO抑制劑選自肼衍生物、丙烯基胺和炔丙基胺、4-取代的-2- 丁炔基胺、鹵代烯丙基胺、吡咯啉衍生物、炔丙基二胺、烯丙基胺、二胺、4，5，6，7-四氫咪唑并[4，5-c]吡啶衍生物、氨基硫羰基衍生物、羧酰胺、磺酰胺、噻唑和/或胍衍生物、肟衍生物、二肼、芳基烷基胺、'^唑烷酮、鹵代烷基胺、苯磷硫胺和咪唑并吡啶衍生物。
8.VAP-I抑制劑用于生產(chǎn)治療纖維變性疾病的藥物的用途。
9.權(quán)利要求8的用途，其中所述VAP-I抑制劑選自抗VAP-I抗體和SSAO抑制劑。
10.權(quán)利要求9的用途，其中所述抗體是包含選自SEQID NO 1-3的1-3個(gè)⑶R共有序列的完全人類(lèi)抗VAP-I抗體和/或包含選自SEQ ID N024-26的1_3個(gè)⑶R共有序列的輕鏈多肽。
11.權(quán)利要求9的用途，其中所述抗體具有包含選自SEQID NO 4-8的第一⑶R序列、選自SEQ ID NO 9-13的第二 CDR序列和選自SEQ IDNO 14-18的第三CDR序列的重鏈多肽和/或包含選自SEQ ID NO 27-31的第一 CDR序列、選自SEQ ID NO 32-36的第二 CDR序列和選自SEQ IDNO 37-41的第三⑶R序列的輕鏈多肽。
12.權(quán)利要求9的用途，其中所述抗體具有包含選自SEQID NO 19-23的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)和包含選自SEQ ID NO 42-46的氨基酸序列的各個(gè)輕鏈可變區(qū)。
13.權(quán)利要求9的用途，其中所述抗體是包含SEQID NO 47中所述的重鏈多肽和SEQID NO 48中所述的輕鏈多肽的完全人類(lèi)重組抗體。
14.權(quán)利要求9的用途，其中所述SSAO抑制劑選自肼衍生物、丙烯基胺和炔丙基胺、4-取代的-2-丁炔基胺、鹵代烯丙基胺、吡咯啉衍生物、炔丙基二胺、烯丙基胺、二胺、4，5，6，7-四氫咪唑并[4，5-c]吡啶衍生物、氨基硫羰基衍生物、羧酰胺、磺酰胺、噻唑和/或胍衍生物、肟衍生物、二肼、芳基烷基胺、,唑烷酮、鹵代烷基胺、苯磷硫胺和咪唑并吡啶衍生物。
15.權(quán)利要求9的用途，其中所述纖維變性疾病選自肝纖維變性和誘發(fā)其的炎癥疾病，即急性和慢性肝炎、膽道疾病和中毒性肝損傷、肺纖維變性、腎纖維變性，包括糖尿病性腎病導(dǎo)致的腎纖維變性，骨髓纖維變性、胰纖維變性、硬皮病、結(jié)締組織疾病、瘢痕、皮膚纖維變性、心臟纖維變性、器官移植、血管狹窄、再狹窄、動(dòng)脈纖維變性、關(guān)節(jié)纖維變性、乳房纖維變性、肌肉纖維變性、腹膜后纖維變性、甲狀腺纖維變性、淋巴結(jié)纖維變性、膀胱纖維變性、胸膜纖維變性和COPD，所述COPD是這樣的疾病，其中氣管壁隨肌成纖維細(xì)胞和膠原的積累而纖維變性，并且與所有纖維變性組織一樣，是收縮的。
16.在需要其的人類(lèi)受試者中預(yù)防、治療或減輕纖維變性疾病的方法，所述方法包括向所述患者施用有效量的VAP-I抑制劑。
17.權(quán)利要求16的方法，其中所述VAP-I抑 制劑選自抗VAP-I抗體和SSAO抑制劑。
18.權(quán)利要求17的方法，其中所述抗體是包含選自SEQID NO 1-3的1_3個(gè)⑶R共有序列的完全人類(lèi)抗VAP-I抗體和/或包含選自SEQ IDNO 24-26的1_3個(gè)⑶R共有序列的輕鏈多肽。
19.權(quán)利要求17的方法，其中所述抗體具有包含選自SEQID NO 4_8的第一⑶R序列、選自SEQ ID NO 9-13的第二 CDR序列和選自SEQ IDNO 14-18的第三CDR序列的重鏈多肽和/或包含選自SEQ ID NO 27-31的第一 CDR序列、選自SEQ ID NO 32-36的第二 CDR序列和選自SEQ IDNO 37-41的第三⑶R序列的輕鏈多肽。
20.權(quán)利要求17的方法，其中所述抗體具有包含選自SEQID N019-23的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)和包含選自SEQ ID NO 42-46的氨基酸序列的各個(gè)輕鏈可變區(qū)。
21.權(quán)利要求17的方法，其中所述抗體是包含SEQID NO 47中所述的重鏈多肽和SEQID NO 48中所述的輕鏈多肽的完全人類(lèi)重組抗體。
22.權(quán)利要求17的方法，其中所述SSAO抑制劑選自肼衍生物、丙烯基胺和炔丙基胺、4-取代的-2-丁炔基胺、鹵代烯丙基胺、吡咯啉衍生物、炔丙基二胺、烯丙基胺、二胺、4，5，6，7-四氫咪唑并[4，5-c]吡啶衍生物、氨基硫羰基衍生物、羧酰胺、磺酰胺、噻唑和/或胍衍生物、肟衍生物、二肼、芳基烷基胺、唑烷酮、鹵代烷基胺、苯磷硫胺和咪唑并吡啶衍生物。
23.權(quán)利要求16的方法，其中所述纖維變性疾病選自肝纖維變性和誘發(fā)其的炎癥疾病，即急性和慢性肝炎、膽道疾病和中毒性肝損傷、肺纖維變性、腎纖維變性，包括糖尿病性腎病導(dǎo)致的腎纖維變性，骨髓纖維變性、胰纖維變性、硬皮病、結(jié)締組織疾病、瘢痕、皮膚纖維變性、心臟纖維變性、器官移植、血管狹窄、再狹窄、動(dòng)脈纖維變性、關(guān)節(jié)纖維變性、乳房纖維變性、肌肉纖維變性、腹膜后纖維變性、甲狀腺纖維變性、淋巴結(jié)纖維變性、膀胱纖維變性、胸膜纖維變性和C0PD，所述COPD是這樣的疾病，其中氣管壁隨肌成纖維細(xì)胞和膠原的積累而纖維變性，并且與所有纖維變性組織一樣，是收縮的。
24.診斷受試者中纖維變性疾病的方法，所述方法包括 a)提供來(lái)自所述受試者的體液的樣品， b)測(cè)定所述樣品中可溶性VAP-l(sVAP-l)的量或SSAO活性， c)基于所述sVAP-1的量或SSAO活性診斷纖維變性。
25.權(quán)利要求24的方法，其中將所述sVAP-1的量或SSAO活性與參照體液中sVAP_l的量或SSAO活性比較。
26.權(quán)利要求24的方法，其中所述sVAP-1的量使用VAP-I特異性抗體測(cè)定。
27.權(quán)利要求24所述的方法，其中所述體液是血清或血漿。
28.權(quán)利要求24的方法，其中所述纖維變性疾病選自肝纖維變性和誘發(fā)其的炎癥疾病，即急性和慢性肝炎、膽道疾病和中毒性肝損傷、肺纖維變性、腎纖維變性，包括糖尿病性腎病導(dǎo)致的腎纖維變性，骨髓纖維變性、胰纖維變性、硬皮病、結(jié)締組織疾病、瘢痕、皮膚纖維變性、心臟纖維變性、器官移植、血管狹窄、再狹窄、動(dòng)脈纖維變性、關(guān)節(jié)纖維變性、乳房纖維變性、肌肉纖維變性、腹膜后纖維變性、甲狀腺纖維變性、淋巴結(jié)纖維變性、膀胱纖維變性、胸膜纖維變性和COPD，所述COPD是這樣的疾病，其中氣管壁隨肌成纖維細(xì)胞和膠原的積累而纖維變性，并且與所有纖維變性組織一樣，是收縮的。
29.權(quán)利要求24的方法，其中所述診斷包括測(cè)定纖維變性的程度。
30.用于權(quán)利要求24的方法的試劑盒，其包含用于評(píng)估體液中sVAP-1的量或SSAO活性的一種或多種試劑。
31.權(quán)利要求30的試劑盒，其用于評(píng)估sVAP-1的量，包含特異性抗VAP-I抗體。
全文摘要
本發(fā)明涉及VAP-1的抑制劑，及其作為藥物在治療纖維變性疾病中的用途。此外，本發(fā)明涉及基于在體液中可溶性VAP-1或SSAO活性的升高水平診斷纖維變性疾病的方法，并涉及用于所述診斷方法的試劑盒。
文檔編號(hào)G01N33/577GK102740886SQ201080050348
公開(kāi)日2012年10月17日 申請(qǐng)日期2010年9月7日 優(yōu)先權(quán)日2009年9月8日
發(fā)明者C·韋斯頓, D·亞當(dāng)斯, D·史密斯, L·C·克拉里德格, M·皮赫拉維斯托, N·韋斯特倫德, T·厄斯特曼 申請(qǐng)人:伯明翰大學(xué), 生物結(jié)治療公司