測(cè)定α-淀粉酶活性的電化學(xué)傳感器、其制備方法及應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種測(cè)定α-淀粉酶活性的電化學(xué)傳感器，采用三電極電化學(xué)體系，工作電極、參比電極和輔助電極分別通過不同導(dǎo)線連接于控制電位儀的對(duì)應(yīng)接線端，工作電極由聚四氟乙烯管和金電極組成，金電極從聚四氟乙烯管中穿過并與聚四氟乙烯管固定嵌套組裝在一起，金電極的底端連接有引出的工作電極引線，工作電極引線與控制電位儀的一個(gè)接線端連接，金電極的頂端固定α-淀粉酶底物。本發(fā)明還公開了一種工作電極的制備方法，依次由待處理的工作電極前處理工藝過程和底物固定的方法工藝過程組成，通過共價(jià)鍵層層修飾使得底物的固定非常穩(wěn)定。本發(fā)明電化學(xué)傳感器的選擇性和靈敏度高、穩(wěn)定性好，可以用于血清和尿液中α-淀粉酶的檢測(cè)。
【專利說明】測(cè)定α -淀粉酶活性的電化學(xué)傳感器、其制備方法及應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種電化學(xué)傳感器、其制備方法及應(yīng)用，特別是涉及一種三電極電化學(xué)傳感器、其制備方法及應(yīng)用，能高效、靈敏、快速檢測(cè)體液內(nèi)的α-淀粉酶活性水平，應(yīng)用于醫(yī)療、保健和生命化學(xué)分析【技術(shù)領(lǐng)域】。
【背景技術(shù)】
[0002]α-淀粉酶廣泛存在于人體組織中，參與許多生命過程。在人體正常血液中，α -淀粉酶含量低，且濃度變化不大，但在胰腺炎和唾液腺炎病人中，其濃度會(huì)增加。臨床上，通過檢測(cè)血清和尿α-淀粉酶的活性來診斷胰腺炎。同時(shí)，α-淀粉酶是肥胖癥和糖尿病藥物的一個(gè)重要作用靶點(diǎn)，其活性的抑制可以減少肥胖癥和糖尿病的發(fā)病率。由此可見，檢測(cè)α-淀粉酶的活性具有重要的意義。
[0003]目前測(cè)定α-淀粉酶活性的方法有紫外分光光度法、色譜法、免疫法和電化學(xué)法。紫外分光光度法操作簡(jiǎn)單、準(zhǔn)確度高、重現(xiàn)性好，但對(duì)測(cè)試溶液的渾濁度很敏感，易造成較大測(cè)試誤差。色譜法需要大型儀器設(shè)備，檢測(cè)速度慢，分析成本高。免疫法所需試劑價(jià)格昂貴，并且需對(duì)測(cè)試溶液進(jìn)行染色，測(cè)試程序復(fù)雜，耗費(fèi)時(shí)間較長(zhǎng)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]為了解決現(xiàn)有技術(shù)問題，本發(fā)明的目的在于克服已有技術(shù)存在的不足，提供一種測(cè)定α-淀粉酶活性的電化學(xué)傳感器，能高效、靈敏、快速檢測(cè)α-淀粉酶活性參數(shù)，儀器制造成本低廉，應(yīng)用于生命物質(zhì)的電化學(xué)檢測(cè)前景優(yōu)異，測(cè)得數(shù)據(jù)準(zhǔn)確可靠。
[0005]為達(dá)到上述發(fā)明創(chuàng)造目的，本發(fā)明采用下述技術(shù)方案:
一種測(cè)定α-淀粉酶活性的電化學(xué)傳感器，采用三電極電化學(xué)體系，包括工作電極、參比電極和輔助電極，工作電極、參比電極和輔助電極分別通過不同導(dǎo)線連接于控制電位儀的對(duì)應(yīng)接線端，工作電極由聚四氟乙烯管和金電極組成，金電極從聚四氟乙烯管中穿過并與聚四氟乙烯管固定嵌套組裝在一起，金電極的底端連接有引出的工作電極引線，工作電極引線與控制電位儀的一個(gè)接線端連接，金電極的頂端固定α -淀粉酶底物。
[0006]上述α -淀粉酶底物優(yōu)選為麥芽低聚糖。
[0007]上述α -淀粉酶底物優(yōu)選采用麥芽四糖、麥芽五糖、麥芽六糖、麥芽七糖或麥芽八糖。
[0008]上述參比電極優(yōu)選采用飽和甘汞電極，輔助電極優(yōu)選采用鉬絲電極。
[0009]本發(fā)明還提供一種測(cè)定α-淀粉酶活性的電化學(xué)傳感器的工作電極的制備方法，依次由待處理的工作電極前處理工藝過程和底物固定的方法工藝過程組成，具體為:
I)待處理的工作電極前處理工藝過程包括如下步驟:
首先將待處理的工作電極置于濃硫酸與質(zhì)量分?jǐn)?shù)為30%的過氧化氫的體積比為3:1的溶液中浸泡2?5分鐘后，用雙蒸水沖洗干凈，隨后將工作電極用至少5000目的細(xì)剛玉砂紙打磨，然后依次用粒徑為1.0 μ m，0.3 μ m和0.05 μ m的氧化鋁粉末拋光至鏡面程度，拋光后的工作電極分別在こ醇和雙蒸水中超聲清洗5分鐘以上；
2)底物固定的方法エ藝過程包括如下步驟:
a.將在上述待處理的工作電極前處理工藝過程中處理過的工作電極置于0.5M硫酸溶液中，在0?1.6V電壓范圍內(nèi)對(duì)工作電極進(jìn)行循環(huán)伏安掃描，掃速設(shè)置為100mV/S，直至達(dá)到穩(wěn)定，用氮?dú)獯蹈晒ぷ麟姌O表面；
b.將經(jīng)過上述步驟a處理后得到的工作電極浸泡在20mM?30mM半胱胺溶液中，在10°C?30°C室溫下過夜；
c.將經(jīng)過上述步驟b處理后得到的工作電極在質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3%?6%琥珀酐水溶液中浸泡3?5小時(shí)后，然后用ニ甲基甲酰胺沖洗；
d.將經(jīng)過上述步驟c處理后得到的工作電極在體積比為1:1的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3%的ニ異丙基碳ニ亞胺和質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3%的N-N-羥基琥珀酰亞胺混合液中浸泡0.5?I小時(shí)后，繼續(xù)在質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%?6%的4，7，10-三氧-1，13-十三烷ニ胺水溶液中浸泡2?5小時(shí)；
e.將經(jīng)過上述步驟d處理后得到的工作電極在質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%?5%的水合肼溶液中浸泡2?4小時(shí)；
f.將經(jīng)過上述步驟e處理后得到的工作電極用ニ甲基甲酰胺沖洗電極后，在20mM?50mM底物溶液中浸泡8?12小時(shí)，繼續(xù)在質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的吐溫20中浸泡I小時(shí)后，然后用氮?dú)獯蹈?，即得到表面固定有a -淀粉酶底物的工作電極。
[0010]作為本發(fā)明的改進(jìn)技術(shù)方案，重復(fù)上述步驟c和上述步驟d至少一次，延長(zhǎng)工作電極表面和a -淀粉酶底物之間連接鍵，通過共價(jià)鍵層層修飾將a -淀粉酶底物固定到工作電極的表面，使得底物的固定非常穩(wěn)定，從而提高了傳感器的穩(wěn)定性。工作電極和底物之間通過長(zhǎng)鏈化學(xué)鍵連接，使底物保持了高度的自由取向，保證了酶的水解效率。
[0011]本發(fā)明適合應(yīng)用于測(cè)試血清或尿液中的a-淀粉酶。
[0012]本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比較，具有如下顯而易見的突出實(shí)質(zhì)性特點(diǎn)和顯著優(yōu)點(diǎn):
1.本發(fā)明測(cè)定a-淀粉酶活性的電化學(xué)傳感器選擇性好，靈敏度高，檢測(cè)范圍寬；
2.本發(fā)明通過共價(jià)鍵層層修飾將a-淀粉酶底物固定到工作電極的表面，使得底物的固定非常穩(wěn)定，從而提高了傳感器的穩(wěn)定性；
3.本發(fā)明的工作電極和底物之間通過長(zhǎng)鏈化學(xué)鍵連接，使底物保持了高度的自由取向，保證了酶的水解效率；
4.本發(fā)明通過分析a-淀粉酶水解底物后工作電極表面電量變化來檢測(cè)a-淀粉酶活性，從而利用了酶對(duì)底物作用的高度專ー性，使得傳感器抗干擾能力強(qiáng)、特異性高；
5.本發(fā)明避免了酶固定在電極上，保持了a-淀粉酶的最高活性，不僅使a-淀粉酶的檢測(cè)限低至0.022U/mL,而且可以應(yīng)用于檢測(cè)實(shí)際血液和尿液中a -淀粉酶的活性；
6.本發(fā)明基于電化學(xué)分析方法，由于具有高靈敏度、選擇性好、響應(yīng)時(shí)間短、所需儀器設(shè)備價(jià)格低廉等優(yōu)點(diǎn)，能廣泛用于生命物質(zhì)的電化學(xué)檢測(cè)，達(dá)到高效、靈敏、快速檢測(cè)a-淀粉酶活性的目的。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0013]圖1是本發(fā)明實(shí)施例一測(cè)定a -淀粉酶活性的電化學(xué)傳感器的結(jié)構(gòu)示意圖。
[0014]圖2是本發(fā)明實(shí)施例一的工作電極的結(jié)構(gòu)示意圖。[0015]圖3是本發(fā)明實(shí)施例一測(cè)定a -淀粉酶活性的電化學(xué)傳感器對(duì)淀粉酶高靈敏性響應(yīng)圖。
[0016]圖4是本發(fā)明實(shí)施例ニ測(cè)定a -淀粉酶活性的電化學(xué)傳感器對(duì)淀粉酶高選擇性響應(yīng)圖。
[0017]圖5是本發(fā)明實(shí)施例三測(cè)定a -淀粉酶活性的電化學(xué)傳感器對(duì)淀粉酶高穩(wěn)定性響應(yīng)圖。
【具體實(shí)施方式】
[0018]本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例詳述如下:
實(shí)施例一:
在本實(shí)施例中，參見圖1和圖2，一種測(cè)定a-淀粉酶活性的電化學(xué)傳感器，采用三電極電化學(xué)體系，包括工作電極1、參比電極2和輔助電極3，工作電極1、參比電極2和輔助電極3分別通過不同導(dǎo)線連接于控制電位儀4的對(duì)應(yīng)接線端，工作電極I由聚四氟こ烯管5和金電極6組成，金電極6從聚四氟こ烯管5中穿過并與聚四氟こ烯管5固定嵌套組裝在一起，金電極6的底端連接有引出的工作電極引線7，工作電極引線7與控制電位儀4的ー個(gè)接線端連接，金電極6的頂端固定a -淀粉酶底物8，底物8采用麥芽五糖，參比電極2為飽和甘汞電極，輔助電極3為鉬絲電極。
[0019]在本實(shí)施例中，測(cè)定a-淀粉酶活性的電化學(xué)傳感器的工作電極的制備方法，依次由待處理的工作電極前處理工藝過程和底物固定的方法エ藝過程組成，具體為:
I)待處理的工作電極前處理方法包括如下エ藝步驟:
首先將待處理的工作電極置于濃硫酸與質(zhì)量分?jǐn)?shù)為30%的過氧化氫的體積比為3:1的溶液中浸泡5分鐘后，用雙蒸水沖洗干凈，隨后將工作電極用5000目的細(xì)剛玉砂紙打磨，然后依次用粒徑為1.0 ii m，0.3 ii m和0.05 ii m的氧化鋁粉末拋光至鏡面程度，拋光后的工作電極分別在こ醇和雙蒸水中超聲清洗5分鐘。
[0020]2)底物固定的方法包括如下エ藝步驟:
將在上述待處理的工作電極前處理工藝過程中處理過的工作電極I置于0.5M硫酸溶液中，在0?1.6V電壓范圍內(nèi)進(jìn)行循環(huán)伏安掃描，掃速設(shè)置為100mV/S，直至達(dá)到穩(wěn)定，用氮?dú)獯蹈?；浸泡?0mM半胱胺溶液中，在15°C室溫下過夜；在質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3%琥珀酐水溶液中浸泡3小時(shí)后，然后用ニ甲基甲酰胺沖洗；在體積比為1:1的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3%的ニ異丙基碳ニ亞胺和質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3%的N-N-羥基琥珀酰亞胺混合液中浸泡0.5小時(shí)后，在質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%的4，7，10-三氧-1，13-十三烷ニ胺水溶液中浸泡5小時(shí)；繼續(xù)在質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3%琥珀酐水溶液中浸泡5小時(shí)后，然后用ニ甲基甲酰胺沖洗；在體積比為1:1的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3%的ニ異丙基碳ニ亞胺和質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3%的N-N-羥基琥珀酰亞胺混合液中浸泡0.5小時(shí)后，在質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%的4，7，10-三氧-1，13-十三烷ニ胺水溶液中浸泡5小時(shí)；在質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%的水合肼溶液中浸泡5小時(shí)；用ニ甲基甲酰胺沖洗工作電極I后，在50mM麥芽五糖溶液中浸泡8小時(shí)后，繼續(xù)在質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的吐溫20中浸泡I小時(shí)后，用氮?dú)獯蹈桑玫禁溠课逄切揎椀墓ぷ麟姌OI。
[0021]在本實(shí)施例中，將工作電極I對(duì)含有不同濃度的a-淀粉酶的標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行測(cè)定，通過信號(hào)物質(zhì)五氨合釕的伏安峰大小，參見圖3可知，采用本實(shí)施例的工作電極I對(duì)α-淀粉酶活性的測(cè)定有好的響應(yīng)性能。在圖3中，a曲線為本實(shí)施例電化學(xué)傳感器測(cè)試不含α-淀粉酶的溶液時(shí)得到的伏安特性曲線，b曲線為本實(shí)施例電化學(xué)傳感器測(cè)試含有
0.0lU/mLa-淀粉酶的標(biāo)準(zhǔn)溶液時(shí)得到的伏安特性曲線，c為本實(shí)施例電化學(xué)傳感器測(cè)試含有0.lU/mL a -淀粉酶的標(biāo)準(zhǔn)溶液時(shí)得到的伏安特性曲線。本實(shí)施例電化學(xué)傳感器選擇性和靈敏度高、穩(wěn)定性好，可以用于血清和尿液中a -淀粉酶的檢測(cè)。
[0022]實(shí)施例二:
本實(shí)施例與實(shí)施例一基本相同，特別之處在于:
在本實(shí)施例中，測(cè)定α-淀粉酶活性的電化學(xué)傳感器的工作電極的制備方法，依次由待處理的工作電極前處理工藝過程和底物固定的方法工藝過程組成，具體為:
I)待處理的工作電極前處理方法包括如下工藝步驟:與實(shí)施例一相同。
[0023]2)底物固定的方法包括如下工藝步驟:
將在上述待處理的工作電極前處理工藝過程中處理過的工作電極I置于0.5M硫酸溶液中，在O?1.6V電壓范圍內(nèi)進(jìn)行循環(huán)伏安掃描，掃速設(shè)置為100mV/S，直至達(dá)到穩(wěn)定，用氮?dú)獯蹈桑唤菰?5mM半胱胺溶液中，在20°C室溫下過夜；在質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4%琥珀酐水溶液中浸泡4小時(shí)后，然后用二甲基甲酰胺沖洗；在體積比為1:1的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3%的二異丙基碳二亞胺和質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3%的N-N-羥基琥珀酰亞胺混合液中浸泡I小時(shí)后，繼續(xù)在質(zhì)量分?jǐn)?shù)為6%的4，7，10-三氧-1，13-十三烷二胺水溶液中浸泡2小時(shí)；繼續(xù)在質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4%琥珀酐水溶液中浸泡4小時(shí)后，然后用二甲基甲酰胺沖洗；在體積比為1:1的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3%的二異丙基碳二亞胺和質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3%的N-N-羥基琥珀酰亞胺混合液中浸泡I小時(shí)后，繼續(xù)在質(zhì)量分?jǐn)?shù)為6%的4，7，10-三氧-1，13-十三烷二胺水溶液中浸泡2小時(shí)；在質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%的水合肼溶液中浸泡2小時(shí)；用二甲基甲酰胺沖洗工作電極I后，在20mM麥芽七糖溶液中浸泡12小時(shí)，繼續(xù)在質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的吐溫20中浸泡I小時(shí)后，用氮?dú)獯蹈?。得到麥芽七糖修飾的工作電極I。
[0024]在本實(shí)施例中，采用本發(fā)明的工作電極1，測(cè)定含有0.lU/mLa -淀粉酶的溶液、含有0.lU/mL a -淀粉酶和5mM的尿素的混合溶液、含有0.lU/mL a -淀粉酶和0.1mM L-半胱氨酸的混合溶液和含有0.lU/mL a -淀粉酶和0.1mM抗壞血酸的混合溶液中a -淀粉酶的活性，參見圖4。在圖4中，a曲線為含有0.lU/mLa -淀粉酶的溶液水解本實(shí)施例工作電極I上底物8修飾層后信號(hào)物質(zhì)五氨合釕的響應(yīng)曲線；b曲線為含有0.lU/mLa -淀粉酶和5mM的尿素的混合溶液水解本實(shí)施例工作電極I上底物8修飾層后信號(hào)物質(zhì)五氨合釕的響應(yīng)曲線；c曲線為含有0.lU/mL a -淀粉酶和0.1mM L-半胱氨酸的混合溶液水解本實(shí)施例工作電極I上底物8修飾層后信號(hào)物質(zhì)五氨合釕的響應(yīng)曲線；d曲線為含有0.lU/mL a -淀粉酶和0.1mM抗壞血酸的混合溶液水解本實(shí)施例工作電極I上底物8修飾層后信號(hào)物質(zhì)五氨合釕的響應(yīng)曲線。從圖4中可知，在尿素、L-半胱氨酸和抗壞血酸等干擾物質(zhì)存在條件下，本實(shí)施例電化學(xué)傳感器對(duì)a-淀粉酶仍具有良好的選擇性響應(yīng)。
[0025]實(shí)施例三:
本實(shí)施例與前述實(shí)施例基本相同，特別之處在于:
在本實(shí)施例中，測(cè)定α-淀粉酶活性的電化學(xué)傳感器的工作電極的制備方法，依次由待處理的工作電極前處理工藝過程和底物固定的方法工藝過程組成，具體為:
I)待處理的工作電極前處理方法包括如下工藝步驟:與實(shí)施例一相同。[0026]2)底物固定的方法包括如下エ藝步驟:
將在上述待處理的工作電極前處理工藝過程中處理過的工作電極I置于0.5M硫酸溶液中，在0~1.6V電壓范圍內(nèi)進(jìn)行循環(huán)伏安掃描，掃速設(shè)置為100mV/S，直至達(dá)到穩(wěn)定，用氮?dú)獯蹈?；浸泡?0 mM半胱胺溶液中，在30°C室溫下過夜；在質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%琥珀酐水溶液中浸泡4小時(shí)后，然后用二甲基甲酰胺沖洗；在體積比為1:1的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3%的二異丙基碳二亞胺和質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3%的N-N-羥基琥珀酰亞胺混合液中浸泡0.5小時(shí)后，繼續(xù)在質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4%的4，7，10-三氧-1，13-十三烷二胺水溶液中浸泡4小時(shí)；在質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%琥珀酐水溶液中浸泡4小時(shí)后，然后用二甲基甲酰胺沖洗；在體積比為1:1的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3%的二異丙基碳二亞胺和質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3%的N-N-羥基琥珀酰亞胺混合液中浸泡0.5小時(shí)后，繼續(xù)在質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4%的4，7，10-三氧-1，13-十三烷二胺水溶液中浸泡4小時(shí)；在質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3%的水合肼溶液中浸泡4小時(shí)；用二甲基甲酰胺沖洗工作電極I后，在30mM麥芽六糖溶液中浸泡10小時(shí)，繼續(xù)在質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的吐溫20中浸泡I小時(shí)后，用氮?dú)獯蹈?，得到麥芽六糖修飾的工作電極I。
[0027]在本實(shí)施例中，將工作電極I在25°C室溫下放置ー個(gè)月后測(cè)定含有0.3U/mLa -淀粉酶的溶液中a -淀粉酶的活性，參見圖5，a曲線為當(dāng)天測(cè)定的含有0.3U/mLa -淀粉酶的溶液水解本實(shí)施例工作電極I上底物8修飾層后信號(hào)物質(zhì)五氨合釕的響應(yīng)；b曲線為放置15天后測(cè)定的含有0.3U/mL a -淀粉酶的溶液水解本實(shí)施例工作電極I上底物8修飾層后信號(hào)物質(zhì)五氨合釕的響應(yīng)曲線曲線為放置30天后測(cè)定的含有0.3U/mL a -淀粉酶的溶液水解本實(shí)施例工作電極I上底物8修飾層后信號(hào)物質(zhì)五氨合釕的響應(yīng)曲線；從該圖5中可知，本實(shí)施例的工作電極I在放置ー個(gè)月后對(duì)a -淀粉酶仍具有良好的響應(yīng)。
[0028]測(cè)試結(jié)果實(shí)驗(yàn)分析: 以本實(shí)施例電化學(xué)傳感器測(cè)定待測(cè)樣品中a-淀粉酶活性為例。
[0029]采用工作曲線法，具體步驟如下:首先將傳感器插入一系列0.003U/mL、0.01U/mL、0.03U/mL、0.lU/mL、0.3U/mL、lU/mL和3U/mL不同濃度的a -淀粉酶標(biāo)準(zhǔn)溶液中，在37°C下溫育10分鐘。然后用二甲基甲酰胺沖洗工作電極I來終止反應(yīng)。再將工作電極I插入含有50ii M五氨合釕，濃度為20 mM的pH6.0羥乙基哌嗪こ硫磺酸緩沖溶液中，通電，產(chǎn)生五氨合釕的電量值。以電量值和a-淀粉酶濃度繪制得到工作曲線。將本實(shí)施例電化學(xué)傳感器插入血清中，在37°C下溫育10分鐘。然后用二甲基甲酰胺沖洗工作電極I來終止反應(yīng)。再將工作電極I插入含有信號(hào)物質(zhì)的緩沖溶液中，通電，產(chǎn)生五氨合釕的電量值。通過對(duì)比工作曲線，可以得到待測(cè)樣品中a -淀粉酶濃度。
[0030]同時(shí)采用本實(shí)施例電化學(xué)傳感器和a -淀粉酶檢測(cè)試劑盒測(cè)定來自人血清和牛血清中a-淀粉酶濃度參見下表?？芍?，本實(shí)施例電化學(xué)傳感器能夠準(zhǔn)確測(cè)定實(shí)際樣品中a-淀粉酶濃度。
【權(quán)利要求】
1.一種測(cè)定a-淀粉酶活性的電化學(xué)傳感器，采用三電極電化學(xué)體系，包括工作電極(I)、參比電極(2)和輔助電極(3)，所述工作電極(I)、所述參比電極(2)和所述輔助電極(3)分別通過不同導(dǎo)線連接于控制電位儀(4)的對(duì)應(yīng)接線端，其特征在干:所述工作電極(I)由聚四氟乙烯管(5)和金電極(6)組成，所述金電極(6)從所述聚四氟乙烯管(5)中穿過并與所述聚四氟乙烯管(5)固定嵌套組裝在一起，所述金電極(6)的底端連接有引出的工作電極引線(7)，所述工作電極引線(7)與所述控制電位儀(4)的ー個(gè)接線端連接，所述金電極(6)的頂端固定a-淀粉酶底物(8)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述測(cè)定a-淀粉酶活性的電化學(xué)傳感器，其特征在于:所述a-淀粉酶底物(8)為麥芽低聚糖。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述測(cè)定a-淀粉酶活性的電化學(xué)傳感器，其特征在于:所述a -淀粉酶底物(8)為麥芽四糖、麥芽五糖、麥芽六糖、麥芽七糖或麥芽八糖。
4.根據(jù)權(quán)利要求1~3中任意一項(xiàng)所述測(cè)定a-淀粉酶活性的電化學(xué)傳感器，其特征在于:所述參比電極(2)為飽和甘汞電極，所述輔助電極(3)為鉬絲電極。
5.一種權(quán)利要求1所述測(cè)定a-淀粉酶活性的電化學(xué)傳感器的工作電極的制備方法，其特征在于，依次由待處理的工作電極前處理工藝過程和底物固定的方法エ藝過程組成，具體為: 1)待處理的工作電極前處理工藝過程包括如下步驟: 首先將待處理的工作電極置于濃硫酸與質(zhì)量分?jǐn)?shù)為30%的過氧化氫的體積比為3:1的溶液中浸泡2~5分鐘后，用雙 蒸水沖洗干凈，隨后將工作電極用至少5000目的細(xì)剛玉砂紙打磨，然后依次用粒徑為1.0 ii m，0.3 ii m和0.05 ii m的氧化鋁粉末拋光至鏡面程度，拋光后的工作電極分別在こ醇和雙蒸水中超聲清洗5分鐘以上； 2)底物固定的方法エ藝過程包括如下步驟: a.將在上述待處理的工作電極前處理工藝過程中處理過的工作電極置于0.5M硫酸溶液中，在0~1.6V電壓范圍內(nèi)對(duì)工作電極進(jìn)行循環(huán)伏安掃描，掃速設(shè)置為100mV/S，直至達(dá)到穩(wěn)定，用氮?dú)獯蹈晒ぷ麟姌O表面； b.將經(jīng)過上述步驟a處理后得到的工作電極浸泡在20mM~30mM半胱胺溶液中，在10°C~30°C室溫下過夜； c.將經(jīng)過上述步驟b處理后得到的工作電極在質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3%~6%琥珀酐水溶液中浸泡3~5小時(shí)后，然后用二甲基甲酰胺沖洗； d.將經(jīng)過上述步驟c處理后得到的工作電極在體積比為1:1的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3%的二異丙基碳二亞胺和質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3%的N-N-羥基琥珀酰亞胺混合液中浸泡0.5~I小時(shí)后，繼續(xù)在質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%~6%的4，7，10-三氧-1，13-十三烷二胺水溶液中浸泡2~5小時(shí)； e.將經(jīng)過上述步驟d處理后得到的工作電極在質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%~5%的水合肼溶液中浸泡2~4小時(shí)； f.將經(jīng)過上述步驟e處理后得到的工作電極用二甲基甲酰胺沖洗電極后，在20mM~50mM底物溶液中浸泡8~12小時(shí)，繼續(xù)在質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的吐溫20中浸泡I小時(shí)后，然后用氮?dú)獯蹈?，即得到表面固定有a -淀粉酶底物的工作電極。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述工作電極的制備方法，其特征在于:重復(fù)上述步驟c和上述步驟d至少一次，延長(zhǎng)工作電極表面和a -淀粉酶底物之間連接鍵。
7.ー種利用權(quán)利要求1所述測(cè)定a-淀粉酶活性的電化學(xué)傳感器的應(yīng)用， 其特征在于:應(yīng)用于測(cè)試血清或尿液中的a-淀粉酶。
【文檔編號(hào)】G01N27/30GK103604848SQ201310586945
【公開日】2014年2月26日 申請(qǐng)日期:2013年11月20日 優(yōu)先權(quán)日:2013年11月20日
【發(fā)明者】李根喜, 張娟, 崔俊慧, 肖 琳 申請(qǐng)人:上海大學(xué)