一種檢測過氧化氫的熒光探針及其制備方法和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種熒光探針，特別涉及一種新響應(yīng)基團(tuán)、選擇性好的近紅外染料熒 光探針，其合成方法及其在檢測細(xì)胞內(nèi)過氧化氫的應(yīng)用，屬于檢測技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 細(xì)胞內(nèi)絕大部分過氧化氫是由線粒體呼吸鏈產(chǎn)生，首先氧氣(02)被還原生成02'， 隨后〇 2 '經(jīng)超氧化物歧化酶(SODs)的歧化作用轉(zhuǎn)變成過氧化氫。
[0003]在生物體中，過氧化氫是一種主要的活性氧，在細(xì)胞信號傳導(dǎo)過程中扮演重要的 角色。過氧化氫不僅能產(chǎn)生其他活性氧，而且是其他活性氧發(fā)生氧化反應(yīng)時的產(chǎn)物。細(xì)胞受 至_激會產(chǎn)生活性氧爆發(fā)，這會影響到幾類能調(diào)控細(xì)胞增殖和凋亡的信號蛋白，例如激活 細(xì)胞有絲分裂的蛋白激酶家族(MAP)、轉(zhuǎn)綠因子l(AP-l)、蛋白質(zhì)絡(luò)氨酸磷酸酶(pTps)、離子 通道和G蛋白。過氧化氫在細(xì)胞中的生物化學(xué)作用非常復(fù)雜，現(xiàn)在普遍認(rèn)為過氧化氫是細(xì)胞 信號傳導(dǎo)的第二信使分子，細(xì)胞內(nèi)R0S尤其是過氧化氫含量的相對穩(wěn)定是維持細(xì)胞活性所 必需的，因此過氧化氫在信號通路中起著非常重要的作用。
[0004]許多與人類衰老相關(guān)的疾病，比如癌癥、心血管疾病、神經(jīng)退行性疾病均與氧化應(yīng) 激有關(guān)，氧化應(yīng)激是活性氧不受調(diào)控過量產(chǎn)生的結(jié)果，而細(xì)胞內(nèi)氧化還原化學(xué)反應(yīng)的紊亂 會進(jìn)一步損害組織和器官。在機(jī)體中，過氧化氫是一種主要的氧代謝產(chǎn)物，也是氧化應(yīng)激的 標(biāo)志物。因此，準(zhǔn)確檢測細(xì)胞內(nèi)過氧化氫的含量是非常重要的。
[0005]目前，過氧化氫的檢測技術(shù)有熒光法、電化學(xué)法、生物發(fā)光法、化學(xué)發(fā)光法等。熒光 法由于其操作簡單、靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)受到了越來越多的關(guān)注。
[0006] 近年來，用于檢測過氧化氫的大多數(shù)探針是以硼酸(Naama Karton_Lifshin，Ehud Segal ,Liora Omer,Moshe Portnoy ,Ronit Satchi-Fainaro, and Doron Shaba , J.Am.Chem.Soc.,2011,133,10960-10965；Lin Yuan,ffeiying Lin,Sheng Zhao,ffensha Gao，Bin Chen,Longwei He,and Sasa Zhu,J.Am.Chem.Soc.,2012,134,13510-13523)或硼 酉愛酯（Duangkhae Srikun,Evan ff.Miller,Dylan ff.Domaille,and Christopher J.Chang, J.Am.Chem.Soc.,2008,130,4596-4597；Dickinson,B.C.；Huynh ,C.；Chang ,C.J., J · Am. Chem · Soc · , 2010,132,5906)作為過氧化氫的響應(yīng)基團(tuán)，但是已有文章 （Thomas F. Brewer ,Francisco J. Garcia, Carl S.Onak,Kate S. Carroll,and Christopher J · Chang, Annu · Rev · Biochem· , 2015,84: 765-790 ·)報道，0N00-會對這類響應(yīng)基團(tuán)造成干 擾，另外近幾年發(fā)表的幾篇文章 （Sikora A，Zielonka J，Lopez M，Joseph J，Kalyanaraman B,Free Radic.Biol.Med.,2009,47:1401-7；Zielonka J,Sikora A,Hardy M,Joseph J, Dranka BP,Ka1yanaraman B.,Chem.Res.Toxicol.,2012,25:1793-99；Ji Zhou,Yang Li , Jiaoning Shen,Qiang Li ,Rui Wang,Yufang Xuand Xuhong Qian,RSC Adv.,2014,4, 51589-51592)中詳細(xì)的介紹了以硼酸或硼酸酯作為響應(yīng)基團(tuán)的探針也能與ONOO'CKT發(fā)生 反應(yīng)并引起探針熒光的變化，而且與0Ν00-的反應(yīng)速度要遠(yuǎn)遠(yuǎn)快于與過氧化氫反應(yīng)的速度。 因此，以硼酸或硼酸酯作為響應(yīng)基團(tuán)的探針對過氧化氫的選擇性尚待提高。
[0007]另外，TetsuoNagano利用一種新的響應(yīng)基團(tuán)設(shè)計(jì)合成了一種過氧化氫焚光探針 (Masahiro Abo ,Yasuteru Urano，Kenjiro Hanaoka, Takuya Terai,Toru Komatsu, and Tetsuo Nagano, J.Am.Chem. Soc. ,2011，133,10629-10637)，雖然該探針具有靈敏度高的優(yōu) 點(diǎn)，但是ONOO'TBHP會對探針造成不同程度的干擾，并且該探針的激發(fā)發(fā)射波長不在近紅 外，不能用于活體成像。
[0008] 總的來說，以上探針都存在選擇性不好的問題，而且大多數(shù)探針的激發(fā)發(fā)射波長 不在近紅外，這會限制探針在生物體中的應(yīng)用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0009] 為克服現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，本發(fā)明提供了一種檢測過氧化氫的熒光探針及其制備方 法和應(yīng)用，設(shè)計(jì)了合成了一種新的過氧化氫近紅外熒光探針，成功的提高了探針對過氧化 氫的選擇性，并應(yīng)用到生物體成像中。
[0010] 為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案為：
[0011] -種檢測過氧化氫的熒光探針，其結(jié)構(gòu)式如下：
[0012]
[0013] 其中，Ri-Ife中任意1個或2個為吸電子基團(tuán)。
[0014] 本發(fā)明的熒光探針響應(yīng)基團(tuán)新穎、選擇性好、靈敏度高;該探針激發(fā)發(fā)射波長在近 紅外，對組織損傷小且穿透力強(qiáng)，能用于活體成像。
[0015] 優(yōu)選的，所述吸電子基團(tuán)為-n〇2、-cn、-s〇3h或-cf 3。該熒光探針效果更好。
[0016] -種檢測過氧化氫的熒光探針的制備方法，將3-氨基苯酚與Cy. 7.C1進(jìn)行取代反 應(yīng)后得到Cy_Ph_NH2，然后經(jīng)過retro-Knoevenagel反應(yīng)得到P-NH2，最后與苯乙醛酸的衍生 物經(jīng)取代反應(yīng)得到產(chǎn)物P-R，即為檢測過氧化氫的熒光探針。
[0017] 本發(fā)明合成方法簡單，適于工業(yè)化生產(chǎn)。
[0018] 其反應(yīng)過程如下：
[0019]
[0020] 其中，中任意1個或2個為吸電子基團(tuán)。
[0021] 優(yōu)選的，所述吸電子基團(tuán)為-n〇2、-cn、-s〇3h或-cf3。
[0022]優(yōu)選的，其反應(yīng)步驟為：
[0023] (1)將二碳酸二叔丁酯（Boc)20與3-氨基苯酚溶解在溶劑中加熱反應(yīng)后得到Ph- Boc ；
[0024] (2)將Cy. 7. Cl、氫化鈉和步驟（1)得到的Ph-Boc溶解在溶劑中反應(yīng)后得到Cy-Ph- Boc ；
[0025] (3)將Cy-Ph-Boc溶解在溶劑中，冰浴后，加入二氣乙酸后，加熱反應(yīng)后得到Cy-Ph_ NH2；
[0026] (4)將Cy-Ph_NH2、氫化鈉溶解在溶劑中加熱回流后得到P-NH2;
[0027] (5)將苯乙醛酸的衍生物溶解在溶劑中，滴入DMF，加入草酰氯加熱反應(yīng)后得到苯 乙醛酰氯的衍生物；
[0028] (6)將P-NH2、三乙胺溶解在溶劑中，滴加苯乙醛酰氯的衍生物，反應(yīng)后得到產(chǎn)物P- R，即為檢測過氧化氫的熒光探針。
[0029] 利用Boc對氨基進(jìn)行保護(hù)，更有利于反應(yīng)的進(jìn)行，提高了產(chǎn)品產(chǎn)率，簡化純化步驟。
[0030] 其反應(yīng)過程如下：
[0031]
[0032] 進(jìn)一步優(yōu)選的，所述步驟(1)的反應(yīng)溫度為75-85°C，反應(yīng)時間為4-6h;
[0033] 所述步驟(2)的反應(yīng)溫度為20-30°C，反應(yīng)時間為2-3h;
[0034] 所述步驟(3)的冰浴時間為1-2h，反應(yīng)溫度為20-30°C，反應(yīng)時間為5-8h;
[0035] 所述步驟(4)的反應(yīng)溫度為85-95°C，反應(yīng)時間為4-6h;
[0036] 所述步驟(5)的反應(yīng)溫度為40_50°C，反應(yīng)時間為l_2h;
[0037] 所述步驟(6)的反應(yīng)溫度為20-30°C，反應(yīng)時間為1 _2h。該條件下得到的產(chǎn)品產(chǎn)率 和純度更高。
[0038] 進(jìn)一步優(yōu)選的，所述步驟（1)的溶劑為無水乙醇，所述步驟(2)和(4)的溶劑為DMF， 所述步驟(3)的溶劑為二氯甲烷，步驟(5)和(6)的溶劑為超干二氯甲烷。
[0039] 更進(jìn)一步優(yōu)選的，所述步驟（1)中3-氨基苯酚、（Boc)20、無水乙醇的用量比例為1: 2-3:30-40，（g:g:mL);
[0040]所述步驟(2)中07.7.(：1、氫化鈉、?11-8〇(3、01^的用量比例為1:0.1-0.2 :0.7-1:15-20, (g:g:g：mL)；
[0041 ] 所述步驟（3)中Cy-Ph-Boc、二氯甲烷、三氟乙酸的用量比例為0.2-0.4: 6-10:1， (g:mL:mL)；
[0042] 所述步驟(4)中Cy-Ph-NH2、氫化鈉、DMF的用量比例為 1:0.03-0.05:12-20,（g:g: mL)；
[0043] 所述步驟(5)中4-硝基苯乙醛酸、超干二氯甲烷、草酰氯、DMF的用量比例為1:80_ 100:1-1.5:0.5-0.8,(g:mL:mL:mL)；
[0044] 所述步驟(6)中P-NH2、三乙胺、4-硝基苯乙醛酰氯、超干二氯甲烷的用量比例為1_ 1.5:0.1-0.5:1:130-150,（g:mL:g:mL)。提高原料的轉(zhuǎn)化率，降低成本。
[0045] 進(jìn)一步優(yōu)選的，所述步驟(2)和(4)的產(chǎn)物純化方法為直接色譜分離;所述步驟(3) 和(6)的產(chǎn)物純化方法為先用飽和碳酸氫鈉水溶液和二氯甲烷萃取，然后有機(jī)相用無水硫 酸鈉干燥，過濾，旋干，最后進(jìn)行色譜分離。
[0046] 更進(jìn)一步優(yōu)選的，所述步驟(2)的色譜分離洗脫劑是石油醚、二氯甲烷和無水乙醇 體積比為20-30:20-30:1的混合液；
[0047]所述步驟(3)的色譜分離洗脫劑是二氯甲烷和無水乙醇體積為為10-20:1的混合 液；
[0048]所述步驟(4)的色譜分離洗脫劑是二氯甲烷和無水乙醇體積為為40-60:3的混合 液；
[0049]所述步驟(6)的色譜分離洗脫劑是二氯甲烷和無水乙醇