專利名稱：用于控制細胞培養(yǎng)物生長的方法
用于控制細胞培養(yǎng)物生長的方法 發(fā)明領域
本發(fā)明涉及高細胞密度培養(yǎng)領域。更具體地，本發(fā)明涉及一種用于通過
補料分批技術(shù)(fed-batch)來控制培養(yǎng)基中培養(yǎng)的微生物生長至高細胞密度的方法。
背景技術(shù)：
振蕩培養(yǎng)物通常是在培養(yǎng)之初便添加所有成分的分批培養(yǎng)物。非受控的 振蕩培養(yǎng)物中容易出現(xiàn)過高的基質(zhì)(substrate)濃度、不充分的通氣、不受控制 的生長、有害代謝物的合成(溢流或無氧代謝)、分解代謝物阻遏、甚至基 質(zhì)中毒。振蕩的大腸桿菌培養(yǎng)物中的生物質(zhì)(biomass )產(chǎn)率范圍通常為1 -2g/l (干重)，微小規(guī)模(microscale)時通常更低。通過精心設計的基質(zhì)補料和pH 控制，在常用的常規(guī)實驗室或工業(yè)生物反應器中可生產(chǎn)高達50倍以上的生物 質(zhì)。較大規(guī)模中應用的控制策略(連續(xù)監(jiān)測和控制)不易應用于少量的振蕩 培養(yǎng)物。連續(xù)監(jiān)測和補料的設置在小規(guī)模中難以實現(xiàn)。非受控的生長和不充 分的通氣會很快引起氧耗盡。氧限制期間，發(fā)酵產(chǎn)物(乙酸根(acetate)、 C02、 曱酸、乳酸、乙醇、琥珀酸)大量形成會抑制細菌生長和損害重組蛋白質(zhì)過 程的量形成。若葡萄糖攝取和糖酵解快于檸檬酸循環(huán)的能力，則這些代謝物 中的一些還可在需氧條件下合成。在此類溢流代謝期間，乙酰CoA轉(zhuǎn)變成被 分泌至培養(yǎng)基的乙酸根。還可在長期暴露于高濃度葡萄糖期間(即使在需氧 條件中)發(fā)生呼吸作用的分解代謝阻遏(Crabtree效應)。
為了避免氧限制、溢流(over-flow )代謝和Crabtree效應，生物反應器 中的高細胞密度培養(yǎng)物通常應用補料分批技術(shù)。在基質(zhì)受限的補料分批培養(yǎng) 中，可用一種限制性基質(zhì)(通常為作為唯一碳源使用的葡萄糖)控制細菌生 長率。氧消耗隨著呼吸活性(基質(zhì)使用)和生長率增加。因此，可通過抑制
微生物生長，也可通過基質(zhì)限制來避免氧限制。然而，大多數(shù)簡單培養(yǎng)是在 搖瓶中在沒有檢測或補料可能性的情況下進行的。所應用的培養(yǎng)方法通常是 分批培養(yǎng)。生物質(zhì)產(chǎn)率通常保持低下，而且如此生產(chǎn)的培養(yǎng)物的品質(zhì)是不可預測的，并且通常是差的。用分批方法達不到高細胞密度，因為此細胞密度 要求如此之高的最初營養(yǎng)物濃度以致其會對微生物有毒。
因為測量和補料裝置通常不可應用于簡單的振蕩培養(yǎng)物，因此已經(jīng)開發(fā) 了備選的策略。在醫(yī)學療法中，通常通過在一段長時間里緩慢釋放基質(zhì)來提 供藥物。藥物投遞樣系統(tǒng)很少應用于微生物培養(yǎng)中，因為基質(zhì)通常是小分子
(諸如葡萄糖和氨水)，對此釋放率難以控制。通過"藥物投遞，，樣系統(tǒng)，Liibbe 等(Appl Microbiol Biotechnol (1985) 22: 424~427)已經(jīng)在帶小棒鏈霉菌 (5Vre/ to^yces (7/<3，//《6^ )培養(yǎng)中才是供1^114(^1， 而且最近,Jeude等(Biotechnol Bioeng (2006) Vol. 96, No. 3:433443)已經(jīng)使用含有葡萄糖的硅氧烷彈性體
(聚二曱基硅氧烷)盤來產(chǎn)生補料分批樣培養(yǎng)條件(還可參見Biichs等WO 2006/119867 "Fermentation method and apparatus for its implementation")。 可 將這些盤添加至培養(yǎng)容器，但是它們不是培養(yǎng)容器的整合部分。然而，僅可 將相對少量的葡萄糖包入此襯質(zhì)(matrix)中。此外，通常在培養(yǎng)開始時此襯質(zhì) 的葡萄糖釋放率最快，此時微生物質(zhì)最低而溢流代謝的風險最高。這可解釋 為何此類系統(tǒng)未曾在生物技術(shù)方面最重要的細菌種類，即大腸桿菌 (Esc/ze〃'c/z/a co/0的簡單培養(yǎng)中快速流^亍。
Tyrell等(J. Bacteriol 75 (1958): 1—4; "Biphasic system for growing bacteria in concentrated culture")已經(jīng)提出了 一種用于將營養(yǎng)物樣酵母提取物包入凝 膠中的方法。然而，該方法沒有控制營養(yǎng)物釋放率的可能性，特別地，該凝 膠的葡萄糖釋放非?？斓匕l(fā)生。因此，不可應用于高細胞密度培養(yǎng)。該方法 從未變得流行，因為富含營養(yǎng)物的、良好緩沖的復合培養(yǎng)基樣超級肉湯(super broth)或極端肉湯(terrific broth)更易于使用，并提供更高的細胞密度。
Green和James (US3926723 "Method of controllably releasing glucose to a cell culture medium" 1975)已經(jīng)提出了 一項關(guān)于動物細胞培養(yǎng)物的有趣申請。 他們使用少量的可溶性淀粉作為細胞的碳源。培養(yǎng)基中使用的馬、豬或牛血 清提供了足夠的催化活性以逐漸釋放少量的葡萄糖。還可使用所添加的酶替 換血清酶。該方法僅使用2g/l淀粉，其在理論上可支持lg/l的最大生物質(zhì)(細 胞)。在人細胞培養(yǎng)物中，沒有獲得細胞數(shù)目的顯著增加。它沒被用于控制 或限制培養(yǎng)物生長率，而是僅被用于阻止一種生長延緩化合物(growth retarding compound),即乳酸的積累。如此，作者似乎沒有意識到作為達到 高細胞密度策略的補料分批技術(shù)，而且由于他們使用低濃度淀粉，他們的方法不可視為高細胞密度培養(yǎng)。對于細菌培養(yǎng)(例如對于大腸桿菌)，該方法
不會起作用復合培養(yǎng)基(諸如血清、酵母提取物或蛋白胨)包含數(shù)種可發(fā)
揮碳源功能的成分。因此，不可通過限制一種碳源(例如葡萄糖)的濃度來 獲得生長控制。在微生物補料分批培養(yǎng)中，每次通常使用化學成分確知培養(yǎng)
基和僅一種限制生長基質(zhì)(growth limiting substrate)。此外，如依照本發(fā)明會 顯示的，僅少量的淀粉可在培養(yǎng)基中保持可溶，以便為高細胞密度微生物培 養(yǎng)提供足夠的葡萄糖。對于需氧生長型微生物，高淀粉量的存在嚴重減弱培 養(yǎng)基的氧傳遞能力，由此提高無氧代謝的風險。針對該原因，需要一種可將 高碳源量裝入培養(yǎng)容器中的智能系統(tǒng)。
迄今公布的緩慢釋放方法受限于l)可縮放性，2)可被裝填至系統(tǒng)的所 投遞基質(zhì)量或3)精確控制基質(zhì)釋放的方法。上文所述方法均未提供解決筒 單振蕩培養(yǎng)物中微生物高細胞密度培養(yǎng)的所有這些實質(zhì)性要求的完整方法。
在基于對基質(zhì)投遞聚合物(substrate delivering polymer)的酶促降解的方法中， 必須在不損害培養(yǎng)基性質(zhì)(例如氧傳遞能力)的情況下向培養(yǎng)容器中加載高
的聚合物量。
發(fā)明概述
在本發(fā)明中，通過對固定化至振蕩生物反應器底部凝膠中的聚合物的酶 促消化意外獲得有益的、受控的基質(zhì)緩慢釋放，所述振蕩生物反應器不含計 算機輔助控制或外部補料裝置。開發(fā)兩相系統(tǒng)以容許l)裝填高碳源量以支 持高細胞密度，所述碳源不可由會被培養(yǎng)的細胞直接消化；和2)延緩所述 不易消化的碳源向液相的釋放。作為一個例子，提出葡糖淀粉酶 (glucoamylase)催化葡萄糖從淀粉的釋放。可避免氧限制，并可在搖瓶和深孔 板中的大腸桿菌培養(yǎng)物中獲得較高的生物質(zhì)?？墒褂门囵B(yǎng)基中少量的葡萄糖 (添加葡糖淀粉酶之前)以迅速獲得足以立即消耗所釋放葡萄糖的細菌。通 過最優(yōu)化的方案，可使用顯著較高的細胞密度以誘導重組基因的表達，隨后 可獲得較高的產(chǎn)物產(chǎn)率。
本發(fā)明提供了一種通過補料分批技術(shù)來控制培養(yǎng)基中培養(yǎng)的微生物生 長至高細胞密度的方法，其中在具有液相(培養(yǎng)基)和固相或膠相的兩相系 統(tǒng)中，固相或膠相提供了一種基質(zhì)投遞聚合物源，其以受控方法被酶轉(zhuǎn)變成 限制生長基質(zhì)或pH調(diào)節(jié)劑。通過利用固相或膠相，可在不損害液相物理性質(zhì)的情況下以支持高細胞密度的量向系統(tǒng)裝填基質(zhì)投遞聚合物。
本發(fā)明將補料分批方法應用于非受控振蕩微生物培養(yǎng)物以在不進行外 部補料的情況下達到高細胞密度(即比通過分批培養(yǎng)獲得的細胞密度高得 多)。通過酶促釋放從被整合或固定化至凝膠的聚合物(例如淀粉)中獲得 限制生長基質(zhì)(例如葡萄糖)。兩相系統(tǒng)的使用容許將高的聚合物量填入培 養(yǎng)容器中，使得其可在不損害液體物理性質(zhì)(例如氧傳遞性質(zhì))的情況下從 固相或膠相緩慢釋放至液相中。聚合物不是立即可利用的，而且基質(zhì)會被酶 以受控方式釋放以獲得想要的釋放率。還可調(diào)整釋放至培養(yǎng)基中的限制生長 基質(zhì)的總量?？蓛H通過例如控制凝膠成分、控制(即改變)酶濃度或控制(即 改變)酶活性(例如通過酶修飾實現(xiàn))來獲得最優(yōu)化的受控基質(zhì)釋放率。此
系統(tǒng)是可縮放的(scaleable)，而且可應用于各種生物反應器系統(tǒng)。
本發(fā)明方法的 一 個優(yōu)點在于可限制細胞培養(yǎng)物中限制生長代謝物 (growth limiting metabolite)的合成。這是通過阻止過量基質(zhì)補料(溢流代謝 的原因)和非受控生長(氧耗盡的原因)獲得的。本發(fā)明的方法還可用于控 制細胞培養(yǎng)物的pH。另一個優(yōu)點在于不需要泵或其它外部裝置，因此培養(yǎng)系 統(tǒng)可以是簡單而合算的。
本發(fā)明的一方面提供了一種用于控制培養(yǎng)基中培養(yǎng)的生物體生長的方 法，其中通過酶促作用以受控方式將限制生長基質(zhì)從基質(zhì)投遞聚合物釋放至 培養(yǎng)基中。所述限制生長基質(zhì)可以是例如營養(yǎng)物或pH調(diào)節(jié)劑。
本發(fā)明的另 一方面提供了 一種用于限制細胞培養(yǎng)物中限制生長代謝物 合成的方法，其中使用所述用于控制生長的方法來向細胞緩慢釋放限制生長 基質(zhì)以限制限制生長代謝物的合成。
本發(fā)明的又一方面提供了一種通過利用上文所述方法來預防細胞培養(yǎng) 物中氧限制(或耗盡，因為這些單詞可互換使用)的方法。
本發(fā)明的又一方面提供了 一種用于控制細胞培養(yǎng)物pH的方法，其中通過 聚合物降解酶(polymer-degrading enzyme)的酶促作用以受控方式將pH調(diào)節(jié) 劑從聚合物釋放至培養(yǎng)基中。
本發(fā)明的又一方面提供了能夠通過聚合物降解酶的酶促作用以受控方 式將限制生長基質(zhì)釋放至細胞培養(yǎng)基中的凝膠樣物質(zhì)的用途，用于通過本發(fā) 明的方法來控制培養(yǎng)基中培養(yǎng)的生物體的生長。
本發(fā)明的又一方面提供了 一種基于高細胞密度補料分批技術(shù)(highcell-density fed匿batch technology-based )的；咅養(yǎng)系統(tǒng)，用于通過本發(fā)明的方法
來控制培養(yǎng)基中培養(yǎng)的微生物的生長。
本發(fā)明的又一方面提供了 一種基于高細胞密度補料分批技術(shù)的試劑盒， 用于通過本發(fā)明的方法來控制培養(yǎng)基中培養(yǎng)的微生物的生長。
附圖簡述
圖l顯示了如何可應用本發(fā)明方法的原理?；|(zhì)投遞是基于包含液體培 養(yǎng)基和基質(zhì)投遞凝膠的兩相系統(tǒng)。限制生長基質(zhì)來源于被結(jié)合至凝膠的聚合 物。聚合物逐漸釋放至培養(yǎng)基，其中一種特定的酶從A)單層凝膠，B)雙層 凝膠系統(tǒng)，其中覆蓋凝膠延緩聚合物的釋放，C)微生物自身生成基質(zhì)消化 酶的系統(tǒng)中釋放基質(zhì)。在圖l中，所述凝膠或雙層凝膠系統(tǒng)處于底板形式。
圖2顯示了可通過優(yōu)化葡糖淀粉酶濃度獲得從淀粉至葡萄糖的期望釋放 率，所述葡糖淀粉酶自淀粉(A)中移去單個葡萄糖?？赏ㄟ^在淀粉瓊脂凝膠(B) 上部投放瓊脂薄層(上部凝膠)來延緩淀粉從凝膠向培養(yǎng)基的釋放。
圖3顯示了在大腸桿菌振蕩培養(yǎng)中所述方法在控制生長和提供高細胞密 度方面起作用。在600nm或490nm波長處光學測量細菌生長。A)含10g/l初始 葡萄糖濃度的無機鹽培養(yǎng)基中的非優(yōu)化振蕩分批培養(yǎng)。非受控生長不久便消 盡所有氧。有害代謝物的積累使生長停止。B)在搖瓶培養(yǎng)中通過本發(fā)明方 法獲得的微生物生長控制。葡萄糖濃度不久便變?yōu)橄拗粕L，并且獲得高細 胞密度。C)微量滴定板培養(yǎng)(100)il液體體積)中的細胞產(chǎn)率和生長速度。 通過正確的酶定量給料，可獲得高細胞密度。
圖4顯示了誘導細胞密度對深孔板培養(yǎng)(培養(yǎng)基體積0.7ml， 0.5ml雙層淀 粉-瓊脂層)中大腸桿菌生成的重組溶菌酶的產(chǎn)率的影響。用0.5mMIPTG進 行重組基因表達的誘導。作為參照，顯示了LB培養(yǎng)基中的培養(yǎng)誘導(誘導細 胞密度OD60。 = 0.6 )。通過本發(fā)明的方法，可使用比普通方案(通常使用0.2-0.6 的誘導細胞密度(OD6W)))高得多的細胞密度。
發(fā)明詳述
本發(fā)明提供了一種通過補料分批技術(shù)來控制培養(yǎng)基中培養(yǎng)的微生物生 長至高細胞密度的方法
在用于本文時，"高細胞密度培養(yǎng)"指產(chǎn)生極其多個微生物細胞的培養(yǎng)。這需要大量的營養(yǎng)物。為了避免高營養(yǎng)物濃度的抑制或毒性效應，通常必須
應用如在膜生物反應器中連續(xù)沖洗(flushing)營養(yǎng)物和代謝物或緩慢的基質(zhì)
補料(補料分批)等策略。高細胞密度值依賴于微生物。它可被定義為在不 進行營養(yǎng)物逐漸添加(補料分批)的情況下、在不對微生物產(chǎn)生毒性的前提 下不會達到的細胞密度。
在用于本文時，"分批培養(yǎng)"指在培養(yǎng)之初便添加所有成分的培養(yǎng)方法。 培養(yǎng)過程中不發(fā)生外部補料。在用于本文時，"補料分批"指培養(yǎng)過程中逐 漸加進營養(yǎng)物的培養(yǎng)。在用于本文時，"基質(zhì)受限的補料分批，，指用一種限 制性營養(yǎng)物(例如通過利用葡萄糖作為唯一碳源)控制微生物生長的培養(yǎng)方 法。
本發(fā)明包含具有液相和固相或膠相的兩相系統(tǒng)。 "液相"在用于本文時指能夠起培養(yǎng)基作用的任何合適液相。液相的例 子包括常用的化學成分確知培養(yǎng)基(也稱為無機鹽培養(yǎng)基)的衍生形式。可 通過省略一種或多種成分(例如為所培養(yǎng)生物體碳源的化學品)容易地改良 此類培養(yǎng)基，如此為通過本發(fā)明方法進行的受控的、基質(zhì)受限補料分批提供 基礎。一4史而言，液相包含細胞和酶。
"固相"指能夠提供基質(zhì)投遞聚合物源(source of substrate-delivering polymer)的任何合適固相。固相的一個實施方案是凝膠或凝月交樣襯質(zhì)。"凝 膠樣基質(zhì)"在用于本文時指依照本發(fā)明有用的任何合適凝膠或凝膠樣襯質(zhì)， 諸如瓊脂凝膠、角叉菜凝膠或明膠凝膠。合適固相的非限制性例子還包括任 何不被自由分散至液相的基質(zhì)投遞聚合物。在一個實施方案中，在所述第一 層固相或膠相(first solid or gel phase )上還有另外的第二層凝膠(second gel )， 以便延緩限制生長基質(zhì)的釋放(雙層凝膠系統(tǒng))。第二層凝膠可以是例如底 板上的上部凝膠或珠子上的 一層。
所述固相提供了基質(zhì)投遞聚合物源。在一個實施方案中，基質(zhì)投遞聚合 物是整合或固定化在凝膠樣襯質(zhì)中的。這可以通過將基質(zhì)投遞聚合物添加至 含有凝膠形成化合物(gel-forming compound)(如瓊脂)的水或培養(yǎng)基中來實 現(xiàn)。該液體的加熱溶解凝膠形成化合物，其在冷卻后使基質(zhì)投遞聚合物陷入 凝膠襯質(zhì)中。還可由通過其它化學品或光的作用而聚合的化合物形成凝膠。 在此類情況中，襯質(zhì)不可通過所述酶促作用降解，而是僅充當穩(wěn)定物或支持 物。直接位于襯質(zhì)上的或在襯質(zhì)中的基質(zhì)投遞聚合物可受到酶降解，其中該酶能夠降解聚合物或者其能夠摻入村質(zhì)中，或者基質(zhì)投遞聚合物在通過擴散 而從襯質(zhì)中釋放入培養(yǎng)基之后受到酶降解。在一個實施方案中，在添加液體 部分后，基質(zhì)投遞聚合物開始分散至液相中。在一個實施方案中，基質(zhì)投遞 聚合物不可被微生物直接利用。
適于該酶的、能夠起基質(zhì)投遞聚合物作用的聚合物包括數(shù)類聚合物。在 一個實施方案中，聚合物是多糖，諸如淀粉、瓊脂、角叉菜、糖原和肽聚糖 等。多糖聚合物的一個特定例子是淀粉，其可被葡糖淀粉酶消化以生成葡萄 糖。在另一個實施方案中，聚合物是蛋白質(zhì)或多肽，諸如膠原、明膠等，并 且氨基酸或肽是酶促釋放的。在又一個實施方案中，聚合物是含磷酸酯/鹽
(phosphate)的化合物，諸如核酸和多磷酸鹽等。在又一個實施方案中，聚 合物是含氮化合物，諸如聚丙烯酰胺、多胺、或蛋白質(zhì)。
適于在本發(fā)明方法中使用的酶包括本領域中已知的、能夠消化用于提供 pH調(diào)節(jié)劑或向細胞提供營養(yǎng)物的聚合物的所有酶。此類酶的非限制性例子包 括用于淀粉的淀粉酶和葡糖淀粉酶，和用于蛋白質(zhì)、多肽和富含氨基的化合 物的蛋白酶、肽酶和酰胺酶。說明應用潛力的別的非限制性例子是核酸酶進 行的核酸降解、利用酰胺酶從聚合物中釋放銨基、或用于降解脂類的脂肪酶。 酶可以是添加至培養(yǎng)基的，或者其可以是由微生物所生成的。在后者情況中， 其可以是由生物體天然生成的野生型酶，或者其可以是重組酶?？墒褂盟?加的酶量或由生物體所生成的酶水平來控制營養(yǎng)物從聚合物的釋放。作為與 用微生物生成酶對直接懸浮至培養(yǎng)基中的聚合物(如淀粉)的天然存在消化 的區(qū)別，本發(fā)明提供了一種兩相系統(tǒng)，其可在不損害培養(yǎng)基物理性質(zhì)的情況 下為高細胞密度提供基質(zhì)補料。為了為特定應用提供最優(yōu)化條件，還可使用 酶混合物，并且可在同一次培養(yǎng)中一起應用數(shù)種聚合物。
為了控制微生物生長，基質(zhì)投遞聚合物被酶轉(zhuǎn)變成限制生長基質(zhì)或pH 調(diào)節(jié)劑。為了提供限制基質(zhì)的條件，可控制所使用酶的活性或量(圖2)。
"限制生長基質(zhì)"在用于本文時指影響所培養(yǎng)生物體生長能力的任何合 適物質(zhì)。在一個實施方案中，限制生長基質(zhì)是營養(yǎng)物，諸如大量營養(yǎng)物，例 如葡萄糖。在另一個實施方案中，限制生長基質(zhì)是影響培養(yǎng)基pH的pH調(diào)節(jié) 劑(諸如氨水)，因此控制生長不僅基于其利用度，而且依據(jù)環(huán)境(pH)控制， 如此影響細胞的生長率。可能有益的是，僅使用一類限制生長基質(zhì)以獲得較 好的細胞生長可控性。限制生長基質(zhì)源(即能夠釋放基質(zhì)的聚合物)可以固定化或整合至固相
或膠相。這提供了包含液體培養(yǎng)基和基質(zhì)儲存凝膠(reservoir gel)的兩相系統(tǒng)。 固定化或整合可基于基質(zhì)源的凝膠形成性質(zhì)或基于其它凝膠形成物質(zhì)(例如 瓊脂、角叉菜、明膠、膠原)的使用。通過使用提供基質(zhì)的凝膠替換直接將 聚合物懸浮于液相中，可在沒有嚴重增加培養(yǎng)基粘度或損害培養(yǎng)基氧傳遞率 風險的情況下為高細胞密度培養(yǎng)提供足夠量的基質(zhì)。
可通過對聚合物(或基質(zhì)聚合物)的酶促消化來獲得限制生長基質(zhì)的補 料，所述聚合物被固定化至凝膠(圖l)，在那里其被逐漸釋放至培養(yǎng)基，在 該培養(yǎng)中一種特定的酶降解所述聚合物以產(chǎn)生細胞可利用的基質(zhì)?；|(zhì)的釋 放率可通過酶定量給料緊密控制，所述酶定量給料與基于自硅彈性體襯質(zhì)系 統(tǒng)的葡萄糖釋放的系統(tǒng)相比提供了好得多的基質(zhì)釋放控制。在 一 個實施方案 中，聚合物結(jié)合至單層凝膠(

圖1A)。在另一個實施方案中，聚合物結(jié)合至 雙層凝膠系統(tǒng)，在那里覆蓋凝膠延緩聚合物的釋放(圖1B)。在又一個實施 方案中，聚合物釋放至培養(yǎng)基，在那里微生物自身生成消化酶。在一個實施 方案中，凝膠或凝膠樣襯質(zhì)處于底板形式。在另一個實施方案中，凝膠或凝 膠樣襯質(zhì)處于珠子形式，所述珠子能夠浸泡(swimming)于溶液中的。此類珠 子在本領域中是公知的，并且其大小范圍可以是例如0.5-10mm。 一般而言， 該大小的珠子可用于在瓊脂或角叉菜凝膠中固定化微生物。
還可將基于酶的投遞方法的原理應用于提供氮和提高pH。提供氮的聚合 物化學品可受合適的酶消化。此類系統(tǒng)的例子包括l)可由例如酰胺酶酶促 釋放氨基的聚丙烯酰胺或相應化學品和2)由蛋白酶、肽酶或酰胺酶逐漸消 化的凝膠形成蛋白質(zhì)(例如明膠)。自此類化合物的氨釋放可提高pH，并可 在簡單培養(yǎng)中促進pH的控制。
可如下控制本發(fā)明的方法，即優(yōu)化數(shù)個參數(shù)(諸如凝膠成分、酶濃度、 酶促活性)、或與會立即消耗所釋放基質(zhì)的大量微生物一起培養(yǎng)或在少量限 制基質(zhì)存在下在添加酶之前實施分批培養(yǎng)。
本發(fā)明的方法可在寬泛的體積范圍里縮放，并可在數(shù)種不同的培養(yǎng)設備 和體積上應用。例如，培養(yǎng)容器可以是簡單的振蕩生物反應器或發(fā)酵罐。培 養(yǎng)體積的范圍可以是1-1000升(諸如實驗室發(fā)酵罐)、1-1001113以上(諸如工 業(yè)生產(chǎn)反應器)、10ml-51 (諸如搖瓶)、l-10ml(諸如試管、玻璃小瓶、Falcon 管等)、5(il-lml (諸如微量滴定板、迷你生物反應器(minibioreaction)等)。本發(fā)明還提供了一種用于在通過補料分批技術(shù)而在培養(yǎng)基中培養(yǎng)至高 細胞密度的微生物培養(yǎng)物中限制限制生長代謝物合成的方法，其中使用本發(fā) 明的方法來向所述細胞釋放所述限制生長基質(zhì)以限制限制生長代謝物的合成。
本發(fā)明還提供了一種用于在培養(yǎng)至高細胞密度的微生物細胞培養(yǎng)物中 預防氧限制的方法，其中使用本發(fā)明的方法來向所述細胞緩慢釋放所述限制 生長基質(zhì)以限制氧消耗。
本發(fā)明還提供了能夠?qū)⒒|(zhì)投遞聚合物釋放至微生物細胞培養(yǎng)基中的 凝膠樣物質(zhì)在本發(fā)明方法中的用途。
本發(fā)明還提供了一種用于控制培養(yǎng)基中培養(yǎng)的微生物生長的基于高細 胞密度補料分批技術(shù)的培養(yǎng)系統(tǒng)，其包含具有液相(培養(yǎng)基)和固相或膠相 的兩相系統(tǒng)，所述固相或膠相提供基質(zhì)投遞聚合物，所述聚合物被安排為以 受控方法被酶轉(zhuǎn)變成限制生長基質(zhì)。
本發(fā)明還提供了一種用于控制培養(yǎng)基中培養(yǎng)的微生物生長的高細胞密 度補料分批技術(shù)培養(yǎng)試劑盒，其包含具有液相(培養(yǎng)基)和固相或膠相的兩 相系統(tǒng)，所述固相或膠相提供基質(zhì)投遞聚合物，所述聚合物被安排為以受控 方法被酶轉(zhuǎn)變成限制生長基質(zhì)。試劑盒還可包含合適的酶和任何所需的合適 瓶子、管形瓶、管、容器、微量滴定板等，而且還包含其如何使用的印刷說 明書。
作為一個非限制性例子，描述用葡糖淀粉酶對淀粉的消化。將可溶性淀 粉固定化至搖瓶或其它簡單生物反應器的底部。兩相系統(tǒng)的設置能為高細胞 密度培養(yǎng)物包裝足夠的聚合物。它還能延緩聚合物釋放至液相中，使得培養(yǎng) 基的氧傳遞潛力不被立即破壞。雖然淀粉可形成穩(wěn)定的凝膠，但是還可添加 瓊脂以加強凝膠，并控制淀粉向培養(yǎng)基的釋放率。聚合物不可立即由缺乏聚 合物降解酶的微生物用作碳源。通過聚合物降解酶的精確定量給料，可實現(xiàn) 規(guī)定的限制生長基質(zhì)釋放率。用不同量的酶和通過對凝膠成分的改良，可控 制基質(zhì)(例如葡萄糖)釋放率。
實施例
將淀粉固定化至凝膠的可操作制備方法的例子是將淀粉(5-10%w/v) 和瓊脂(5-7%w/v)與培養(yǎng)基或水一起混合。在高壓滅菌器中對混合物進行滅菌，冷卻至60。C，振蕩，然后在冷水中快速冷卻以獲得同質(zhì)凝膠結(jié)構(gòu)。凝
固后，添加培養(yǎng)基(通常為不含葡萄糖或具有低葡萄糖含量的無機鹽培養(yǎng)基) 和微生物。
圖l顯示了如何可應用本發(fā)明方法的原理。限制生長基質(zhì)來源于聚合物。 將聚合物固定化至完全或部分由所述聚合物組成的凝膠襯質(zhì)中。聚合物逐漸 釋放至培養(yǎng)基中，其中合適的酶(手動添加的)從聚合物中釋放限制生長營
養(yǎng)物。為了延緩聚合物釋放率，可在聚合物凝膠上放置額外的凝膠(圖1B )。 為了進一步限制限制生長營養(yǎng)物的利用度，可調(diào)節(jié)酶定量給料。圖1C證實微 生物編碼聚合物降解酶的情況。該酶可以是微生物的天然產(chǎn)物或重組產(chǎn)物。 此類系統(tǒng)的一個例子是使用淀粉，其用葡糖淀粉酶(E.C. 3.2丄3.)消化。
如圖2中所見，可通過用葡糖淀粉酶從淀粉中酶促消化葡萄糖來獲得受 控的葡萄糖釋放。通過調(diào)節(jié)酶濃度，可控制反應速率?？赏ㄟ^改變淀粉凝膠
來控制淀粉從凝膠的機械釋放率。
圖3顯示搖瓶中典型的分批培養(yǎng)(A)的特征在于非受控的生長、氧耗盡、 酸性代謝物的積累和細胞產(chǎn)率低下(以低OD6oo觀察的)。比較而言，本發(fā)明 的方法(B)可提供葡萄糖限制、緩慢但恒定的生長，預防氧耗盡，并降低使 培養(yǎng)基酸化的代謝物的積累。圖3顯示了通過優(yōu)化酶定量給料還可在微量滴 定板培養(yǎng)(100pl液體體積)中獲得受控的生長。
用攜帶編碼乳桿菌(Zacto6ac/〃w)噬菌體LL-H溶菌酶(muramidase ， lysozyme)的基因m"r的重組大腸桿菌菌抹BL21(DE3)pET21c調(diào)查本方法對誘 導型重組蛋白質(zhì)生產(chǎn)的適用性。Mur的過量生成對分裂細胞是有害的，因為 被泄漏至周質(zhì)中時，其水解細胞壁胞壁質(zhì)，導致細胞溶解?？扇菀椎囟?Mur活性[Vasala A, Valkkila M, Caldentey J, Alatossava T: Genetic and biochemical characterization of the Lactobacillus delbrueckii subsp. lactis bacteriophage LL-H lysin. Appl Environ Microbiol 1995， 61:楊"Ol 1], 并且 先前已經(jīng)描述了高細胞密度補料分批重組蛋白質(zhì)生物反應器方法[Viitanen Ml, Vasala A, Neubauer P， Alatossava T: Cheese whey-induced high-cell-densities production of recombinant proteins in Escherichia coli. Microb Cell Fact 2003, 2:2]。依照這些研究，每細胞群(cell mass)的Mur產(chǎn)量不 可獲得實質(zhì)性改善。因此，成功的生產(chǎn)策略是基 高誘導細胞密度的使用。使用具有48個樣品位置(2ml體積)的深孔板。樣品孔含有0.6ml淀粉-瓊脂凝 膠(包含0.5ml底部凝膠和0.1ml上部凝膠的雙層凝膠)和含有葡糖淀粉酶的 0.7ml培養(yǎng)基。用各種細胞密度進行的重組Mur生產(chǎn)(圖4)證實所發(fā)明的方 法適用于非受控培養(yǎng)中小規(guī)模的重組蛋白質(zhì)生產(chǎn)。用lmM IPTG (基因ww 的誘導物)在不同的細胞密度誘導用本發(fā)明方法進行培養(yǎng)的細菌，并添加 0.5g/l葡萄糖以確保碳源不會限制蛋白質(zhì)生產(chǎn)。誘導4小時后，獲得誘導細胞 密度和Mur活性之間的線性關(guān)系，此時誘導細胞密度(OD60())高于0.9。用最高 的誘導細胞密度獲得最高的Mur生產(chǎn)。作為參照系統(tǒng)，使用Luria-Bertani (LB) 培養(yǎng)基中培養(yǎng)的、且在OD60()0.6誘導的培養(yǎng)物，因為分批培養(yǎng)中較高的誘導 細胞密度通常產(chǎn)生較低的重組蛋白質(zhì)產(chǎn)率。該實驗證實本發(fā)明的方法可應用 于在簡單振蕩培養(yǎng)物中生產(chǎn)重組蛋白質(zhì)，并容許使用比標準實驗室方案高得 多的細胞密度。
本發(fā)明已經(jīng)著重描述了一些優(yōu)選的實施方案和應用。但是，對本領域技 術(shù)人員顯而易見的是，可制備和使用所公開實施方案的變化形式，而且在下 列權(quán)利要求書的范圍內(nèi)可以本文明確所述方式以外的方式實施本發(fā)明。
權(quán)利要求
1.一種通過補料分批技術(shù)來控制培養(yǎng)基中培養(yǎng)的微生物生長至高細胞密度的方法，其特征在于在具有液相和固相或具有液相和膠相的兩相系統(tǒng)中，固相或膠相提供基質(zhì)投遞聚合物源，而且所述基質(zhì)投遞聚合物以受控方式被酶轉(zhuǎn)變成限制生長基質(zhì)或pH調(diào)節(jié)劑。
2. 權(quán)利要求1的方法，其特征在于所述基質(zhì)投遞聚合物是固定化或整合至 所述固相或膠相中的。
3. 權(quán)利要求1或2的方法，其特征在于通過控制所述凝膠組成、控制所述 酶濃度或控制所述酶活性來獲得受控的基質(zhì)釋放率。
4. 權(quán)利要求3的方法，其特征在于所述基質(zhì)投遞聚合物不可被所述微生物 直接利用。
5. 上述權(quán)利要求任一項的方法，其特征在于在添加所述液體部分后所述 基質(zhì)投遞聚合物開始分散至所述液相中。
6. 上述權(quán)利要求任一項的方法，其特征在于所述酶是添加至所述培養(yǎng)基中的。
7. 上述權(quán)利要求任一項的方法，其特征在于所述酶是由所述微生物生成的。
8. 上述權(quán)利要求任一項的方法，其特征在于所述固相或膠相處于底板形式。
9. 上述權(quán)利要求任一項的方法，其特征在于所述固相或膠相處于珠子形式。
10. 上述權(quán)利要求任一項的方法，其特征在于在所述第一層固相或膠相 上還有另外的第二層凝膠。
11. 上述權(quán)利要求任一項的方法，其特征在于所述基質(zhì)投遞聚合物是多糖。
12. 權(quán)利要求11的方法，其特征在于所述多糖選自淀粉、瓊脂、角叉菜、 糖原和肽聚糖。
13. 權(quán)利要求l-7任一項的方法，其特征在于所述基質(zhì)投遞聚合物是蛋白 質(zhì)或多肽。
14. 權(quán)利要求13的方法，其特征在于所述蛋白質(zhì)或多肽選自膠原和明膠。
15. 權(quán)利要求l-7任一項的方法，其特征在于所述基質(zhì)投遞聚合物是包含 磷酸鹽/酯的化合物。
16. 權(quán)利要求15的方法，其特征在于所述包含磷酸酯/鹽的化合物選自核 酸和多磷酸鹽。
17. 權(quán)利要求l-7任一項的方法，其特征在于所述基質(zhì)投遞聚合物是含氮化合物。
18. 權(quán)利要求17的方法，其特征在于所述含氮化合物選自聚丙烯酰胺、 多胺、或蛋白質(zhì)。
19. 上述權(quán)利要求任一項的方法，其特征在于所述限制生長基質(zhì)是營養(yǎng)物。
20. 上述權(quán)利要求任一項的方法，其特征在于所述限制生長基質(zhì)是pH調(diào)節(jié)劑。
21. 上述權(quán)利要求任一項的方法，其特征在于所述酶選自淀粉酶、蛋白 酶、肽酶、核酸酶和酰胺酶。
22. —種用于在通過補料分批技術(shù)而在培養(yǎng)基中培養(yǎng)至高細胞密度的微 生物培養(yǎng)物中限制限制生長代謝物合成的方法，其特征在于使用權(quán)利要求 l-21任一項的方法來向所述細胞釋放所述限制生長基質(zhì)以限制限制生長代 謝物的合成。
23. —種用于在培養(yǎng)至高細胞密度的微生物細胞培養(yǎng)物中預防氧限制的 方法，其特征在于使用權(quán)利要求l-22任一項的方法來向所述細胞緩慢釋放所 述限制生長基質(zhì)以限制氧消耗。
24.利要求l-22任一項所述的方法中的用途。
25. —種用于控制培養(yǎng)基中培養(yǎng)的微生物生長的基于高細胞密度補料分 批技術(shù)的培養(yǎng)系統(tǒng)，其特征在于其包含具有液相和固相或具有液相和膠相的 兩相系統(tǒng)，所述固相或膠相提供基質(zhì)投遞聚合物，所述基質(zhì)投遞聚合物被安 排為以受控方式被酶轉(zhuǎn)變成限制生長基質(zhì)。
26. —種用于控制培養(yǎng)基中培養(yǎng)的微生物生長的高細胞密度補料分批技 術(shù)培養(yǎng)試劑盒，其特征在于其包含具有液相和固相或具有液相和膠相的兩相 系統(tǒng)，所述固相或膠相提供基質(zhì)投遞聚合物，所述基質(zhì)投遞聚合物被安排為 以受控方式被酶轉(zhuǎn)變成限制生長基質(zhì)。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種通過補料分批技術(shù)來控制培養(yǎng)基中培養(yǎng)的微生物生長至高細胞密度的方法，其中在具有液相(培養(yǎng)基)和固相或膠相的兩相系統(tǒng)中，固相或膠相提供了一種基質(zhì)投遞聚合物源，其以受控方法被酶轉(zhuǎn)變成限制生長基質(zhì)或pH調(diào)節(jié)劑。本發(fā)明還提供了一種用于在微生物細胞培養(yǎng)物中限制限制生長代謝物合成和阻止氧耗盡的方法。
文檔編號C12N1/04GK101595208SQ200780044378
公開日2009年12月2日 申請日期2007年11月29日 優(yōu)先權(quán)日2006年11月30日
發(fā)明者安蒂·瓦薩拉, 彼得·紐鮑爾, 約翰娜·帕努拉-佩拉拉 申請人:奧盧大學