黑曲霉菌株及其孢子粉的制備方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于微生物制品領(lǐng)域，具體涉及一種黑曲霉菌株及其孢子粉的制備方法。該菌株是曲霉屬(Aspergillus)中的黑曲霉SDKYSW-2#，其保藏號(hào)為CGMCC?No.8327。黑曲霉菌株孢子粉的制備方法是菌種活化、種子液的培養(yǎng)、發(fā)酵、后處理即得。本發(fā)明生產(chǎn)工藝成熟，技術(shù)先進(jìn)，尤其在菌種篩選和制劑化方面具有先進(jìn)性，而生產(chǎn)所需要原料價(jià)廉易得，產(chǎn)品附加值很高，而且生態(tài)和社會(huì)效益顯著，具備了效益高、成本低、不污染環(huán)境、對人畜無害的微生物肥料顯著特征。
【專利說明】黑曲霉菌株及其孢子粉的制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于微生物制品領(lǐng)域，具體涉及一種黑曲霉菌株及其孢子粉的制備方法。【背景技術(shù)】 [0002]人類生存與農(nóng)業(yè)可持續(xù)性發(fā)展己成為各國農(nóng)業(yè)發(fā)展的主題?，F(xiàn)代農(nóng)業(yè)(增施水肥、改良品種、集約化栽培、化學(xué)化、機(jī)械化)的高投入高產(chǎn)出的掠奪式運(yùn)作方式已經(jīng)說明是極其有害的。實(shí)踐證明，將傳統(tǒng)農(nóng)業(yè)與現(xiàn)代化農(nóng)業(yè)緊密結(jié)合才有利于人類生存和發(fā)展。自80年代美國人提出根際促生菌以來，某些根際微生物對作物的促進(jìn)作用是可以肯定的，具體作用主要有4個(gè)方面:①影響作物根細(xì)胞的滲透性；②影響根際代謝活動(dòng)；③微生物對根分泌物的吸收作用；④改變營養(yǎng)物質(zhì)對植物的有效性。
[0003]無論是微生物間的相互作用，還是微生物對植物的作用都是通過各種酶類及代謝產(chǎn)物作為介質(zhì)而起作用的。雖然各國科學(xué)工作者對根際促生菌的生物學(xué)和生態(tài)學(xué)已做了大量研究，但對促生菌通過何種介質(zhì)對作物及病原菌發(fā)生作用，尚無確切研究。因此，深入研究根際促生菌代謝產(chǎn)物對作物的生物活性及其分子結(jié)構(gòu)特點(diǎn)有著十分重要的意義。一方面可以明確根際促生菌的作用機(jī)制，另一方面對仿生合成及微生物基因工程改造都有著十分重要的意義。特別是正向調(diào)控菌劑的研制成功，在理論與實(shí)際上都將有重大突破。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的是提供一種黑曲霉菌株，該菌種能夠促進(jìn)作物的生長發(fā)育；本發(fā)明同時(shí)提供了黑曲霉菌株孢子粉的制備方法，簡單易行，適合工業(yè)化生產(chǎn)。
[0005]本發(fā)明所述的黑曲霉菌株是曲霉屬(Aspergillus)中的黑曲霉SDKYSW-2#，黑曲霉菌株已于2013年10月12日，保藏至中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，地址:北京市朝陽區(qū)北辰西路I號(hào)院3號(hào)，中國科學(xué)院微生物研究所，分類命名為黑曲霉(AspergiIIusniger)，保藏號(hào)為 CGMCC N0.8327。
[0006]黑曲霉菌株是從大棚(沂源)苗圃土壤中采用土壤稀釋分離法分離獲得。
[0007]本發(fā)明所述的黑曲霉菌株的篩選方法，包括以下步驟:
[0008]一、土樣采集:從土壤表層到15cm處取樣200g，一個(gè)地點(diǎn)采幾個(gè)樣本，混合過粗篩，取25g作分離用；
[0009]二、黑曲霉的分離:
[0010]1、儀器:
[0011]高壓蒸汽滅菌鍋、烘干箱、培養(yǎng)箱、電子天平、搪瓷杯、燒杯、分裝漏斗、試管、吸管(10ml)、吸爾球、玻璃棒、棉花、線繩、報(bào)紙、培養(yǎng)皿、三角瓶(100ml)、玻璃珠、移液器(lml)、吸頭、藥勺、接種針、酒精燈。
[0012]2、藥品:
[0013]可溶性淀粉，磷酸二氫鉀，硫酸鎂，硫酸亞鐵，瓊脂，蔗糖，黑曲霉。
[0014]3、黑曲霉分離培養(yǎng)基的制備:[0015]可溶性淀粉10g，磷酸二氫鉀0.5g，硫酸鎂0.lg，硫酸亞鐵0.lg，瓊脂10g，蔗糖10g，水500ml ;將試劑稱好，加水放入搪瓷杯中，電爐上加熱溶解，用吸管(IOml)吸培養(yǎng)基IOml分裝試管中，塞好棉塞，用紙包好滅菌，備用。
[0016]培養(yǎng)基制作:試劑一溶解一校正PH值一分裝一加棉塞、包扎一滅菌(0.1P保溫30分鐘)一備用。
[0017]4、操作方法:
[0018](I)準(zhǔn)備工作:
[0019]將使用儀器培養(yǎng)皿、三角瓶、吸頭(若干)、藥勺、培養(yǎng)基、IOml試管等，用高壓滅菌鍋0.1p保壓30分鐘，滅菌備用。
[0020]三角瓶:裝入100ml水加入玻璃珠(若干)。
[0021]IOml試管:裝入9ml水，做好編號(hào)，塞好棉塞，8支，備用。
[0022]培養(yǎng)皿5個(gè)為一組，用報(bào)紙包好，6包30個(gè)。
[0023]Iml吸頭，每個(gè)單獨(dú)用報(bào)紙包好(若干)。
[0024](2)菌樣稀釋分離:
[0025]將待分離的菌樣在無菌條件下，用接種針取1-2環(huán)，放入三角瓶中，瓶內(nèi)菌液約含孢子50-100萬個(gè)/ml，充分振搖5分鐘左右，使孢子個(gè)個(gè)分離混勻，備用。
[0026]在接種箱內(nèi)按無菌`操作要求，用移液器吸取Iml三角瓶內(nèi)菌液放入I號(hào)管，再從I號(hào)管吸Iml放入2號(hào)管，以此類推，直至稀釋至6號(hào)或7號(hào)試管內(nèi)，要求每往試管吸一次換一次吸頭，每毫升稀釋液中約含孢子數(shù)5-10個(gè)之間。
[0027]取5號(hào)6號(hào)7號(hào)試管內(nèi)菌液0.5毫升，放入培養(yǎng)皿中，每個(gè)稀釋度做10個(gè)平板，將培養(yǎng)基(溫度50°C)倒入培養(yǎng)皿中與菌液充分混勻，放平、冷卻。
[0028]大約20分鐘左右待培養(yǎng)皿內(nèi)培養(yǎng)基凝固后取出，倒置放入培養(yǎng)箱內(nèi)(30°C)，培養(yǎng)4天后，即可在平皿培養(yǎng)基上觀察到以每個(gè)孢子為同心圓而生長的菌落，菌落大且孢子密度厚來篩選優(yōu)良的菌株。
[0029]注意事項(xiàng):
[0030]本操作一定要在滅過菌的無菌接種箱內(nèi)進(jìn)行，并嚴(yán)格按無菌操作要求進(jìn)行。
[0031]使用的培養(yǎng)皿規(guī)格及加入的培養(yǎng)基的數(shù)量一定要相同，以便于對不同培養(yǎng)皿中的菌落進(jìn)行比較。
[0032]加入培養(yǎng)基的溫度不宜過熱或過冷，一般控制在45_50°C之間(用手觸摸不燙手)否則會(huì)使孢子燙死或出現(xiàn)培養(yǎng)基表面不平現(xiàn)象。
[0033]每稀釋一次試管，換一次吸頭。
[0034](3)復(fù)篩三角瓶產(chǎn)酶培養(yǎng)基:將無機(jī)鹽溶液加入到干料中，直至配料的含水量為53-55wt.%時(shí)，停止加入無機(jī)鹽溶液；所述干料的質(zhì)量百分比組成為:麩皮50%、豆餅粉30%和花生秸桿粉20% ;所述無機(jī)鹽溶液是每升水中含2.0gKH2PO4U.4g(NH4)2SCV0.3g尿素、0.3gMgS04.7Η20、0.3g CaCl2,5.0mg FeSO4.7Η20、1.56mg MnSO4.H2OU.4mg ZnSO4.7H20、2.0mgCoCl2。裝入三角瓶，500ml三角瓶裝入水分85%的濕料40g，滅菌，接入上述分離的黑曲霉菌株，30°C培養(yǎng)三天后低溫干燥，分析所產(chǎn)生的酶系，見表1。
[0035]表1各種酶的活力分析
[0036]
【權(quán)利要求】
1.一種黑曲霉菌株，其特征在于:該菌株是曲霉屬(Aspergillus)中的黑曲霉SDKYSW-2#，其保藏號(hào)為 CGMCC N0.8327。
2.—種權(quán)利要求1所述的黑曲霉菌株孢子粉的制備方法，其特征在于步驟如下: (1)菌種活化:將黑曲霉菌株接種在斜面培養(yǎng)基上培養(yǎng)， (2)種子液的培養(yǎng):將活化好的菌種加入到種子培養(yǎng)基中培養(yǎng)得到種子液， (3)發(fā)酵:種子液與滅菌后的配料攪拌，保溫發(fā)酵，調(diào)溫發(fā)孢； (4)后處理:將步驟(3)得到的物料低溫干燥得到半成品，加入防腐防紫外線物質(zhì)后干燥，粉碎至標(biāo)準(zhǔn)篩目，孢子收集，復(fù)檢、分裝即得。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的黑曲霉菌株孢子粉的制備方法，其特征在于步驟(1)中所述的斜面培養(yǎng)基是麩皮汁斜面培養(yǎng)基，培養(yǎng)溫度是28-30°C，培養(yǎng)時(shí)間是70-74小時(shí)。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的黑曲霉菌株孢子粉的制備方法，其特征在于步驟(2)中所述的活化好的菌種和種子培養(yǎng)基的體積比是1:8_12。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的黑曲霉菌株孢子粉的制備方法，其特征在于步驟(2)中所述的培養(yǎng)溫度是33-36°C，培養(yǎng)時(shí)間是45-48小時(shí)。
6.根據(jù)權(quán)利要求2所述的黑曲霉菌株孢子粉的制備方法，其特征在于步驟(2)中所述的種子培養(yǎng)基的制備方法如下: 將麥胚、麩皮按質(zhì)量比1:9-`11的比例混勻，用45-50°C溫水反復(fù)沖洗，將得到的清洗液在125-130°C、0.15-0.2Mpa下滅菌40_50min，降溫至33_36°C，制成種子培養(yǎng)基。
7.根據(jù)權(quán)利要求2所述的黑曲霉菌株孢子粉的制備方法，其特征在于步驟(3)中所述的種子液和配料的質(zhì)量比是1:10-12。
8.根據(jù)權(quán)利要求2所述的黑曲霉菌株孢子粉的制備方法，其特征在于步驟(3)中所述的保溫發(fā)酵溫度是32-36°C，保溫發(fā)酵時(shí)間是12-15h ;調(diào)溫發(fā)孢溫度是32_38°C，調(diào)溫發(fā)孢時(shí)間是48-50h。
9.根據(jù)權(quán)利要求2所述的黑曲霉菌株孢子粉的制備方法，其特征在于步驟(3)中所述的配料的制備方法如下: 將無機(jī)鹽溶液加入到干料中，直至配料的含水量為53-55wt.%時(shí)，停止加入無機(jī)鹽溶液； 所述干料的質(zhì)量百分比組成為:麩皮40-50%、豆餅粉30-40%和花生秸桿粉20-30% ； 所述無機(jī)鹽溶液是每升水中含2.0gKH2PO4U.4g(NH4)2SCV0.3g尿素、0.3gMgS04.7Η20、0.3g CaCl2、5.0mg FeSO4.7Η20、1.56mg MnSO4.H20、1.4mg ZnSO4.7H20、2.0mgCoCl2。
10.根據(jù)權(quán)利要求2所述的黑曲霉菌株孢子粉的制備方法，其特征在于步驟(4)中所述的防腐防紫外線物質(zhì)是氧化鋅，防腐防紫外線物質(zhì)和半成品的質(zhì)量比是1-1.2:10000。
【文檔編號(hào)】C12N1/14GK103555593SQ201310548819
【公開日】2014年2月5日 申請日期:2013年11月7日 優(yōu)先權(quán)日:2013年11月7日
【發(fā)明者】周長春, 張旭, 葛英, 劉金鳳 申請人:沂源康源生物科技有限公司