專利名稱：含有冰片的藥物組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及藥物組合物，具體地說，是根據(jù)現(xiàn)代醫(yī)學(xué)理論研制的含有冰片和天然植物提取物或單體的藥用組合物及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
冰片分為天然冰片與合成冰片兩大類。其中，龍腦冰片主要為右旋龍腦，是冰片中的正品，艾片主要為左旋龍腦，而合成冰片除含有龍腦外還含有大量的龍腦的差向異構(gòu)體異龍腦。目前，冰片在臨床上的應(yīng)用(尤其是心腦血管病)極為廣泛，例如復(fù)方丹參類、冠心蘇合丸、安宮牛黃丸、華佗再造丸等均含有冰片。在這類傳統(tǒng)成方中，多利用了冰片“芳香走竄、引藥上行”、“獨行則勢弱、佐使則有功”之功效，作為“藥引”來增加其它藥物的治療效果。
多年來，許多學(xué)者基于現(xiàn)代醫(yī)學(xué)理論，對冰片的藥效學(xué)、藥物動力學(xué)及安全性等方面做了廣泛工作，取得了許多新進(jìn)展。例如，研究發(fā)現(xiàn)冰片不僅僅是“引藥”，其不僅能促某些藥物通透血腦屏障(BBB)，提高某些藥物的生物利用度和血藥濃度，而且冰片誘導(dǎo)的BBB開放與腦炎、腦外傷的病理性開放有著質(zhì)的區(qū)別，其對腦及BBB有一定的保護(hù)作用(趙保勝，中藥新藥與臨床藥理2002年，13(5)287-288)；和冰片對能使冠狀竇血流量回升、減慢心率、降低心肌氧耗量(江文德，藥學(xué)學(xué)報1979，14(11)655-660)；和冰片可能通過改善缺血腦組織的血氧供應(yīng)，進(jìn)而改善該區(qū)域的能量代謝障礙，對缺血腦組織損傷起到保護(hù)作用(何曉靜，華西藥學(xué)雜志2005年，20(4)323-325)；和冰片通過抑制ICAM-1的表達(dá)，從而抑制多形核白細(xì)胞黏附而在腦缺血再灌注損傷的治療中發(fā)揮腦保護(hù)作用(沈強(qiáng)，中西醫(yī)結(jié)合心腦血管病雜志2003年，1(3)136-138)。
上述研究進(jìn)展引起了更多學(xué)者的興趣，他們嘗試著將冰片與其它活性成分組合，以期獲得更佳的療效。例如，ZL2003101172399公開了以冰片為君藥和石菖蒲、川芎、白芷三味共為臣藥的冰川頭痛靈；和200410020426X公開了由川芎、香附、冰片、牡丹皮組成的復(fù)方制劑；方永奇(中國中醫(yī)藥科技2004年，11(6)353-354)公開了β-細(xì)辛醚和冰片的復(fù)方制劑。這些復(fù)方通常是按“辨證論治”的原則組成的，廣泛應(yīng)用于心腦血管疾病的治療，均取得了一定的成果。
然而，上述復(fù)方遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足臨床上日益增長的對冰片的需求。一方面，對于致病機(jī)理復(fù)雜、伴有不同類別并發(fā)癥的疾病，已有的含冰片復(fù)方制劑難以多方位奏效。更為關(guān)鍵的是，雖然已揭示出冰片不僅僅是“引藥”，但是正如有學(xué)者指出的，目前針對冰片本身所進(jìn)行的現(xiàn)代醫(yī)學(xué)意義上的研究尚不能令人滿意，已有成果對后人研究的前瞻性指導(dǎo)意義也頗為有限(劉養(yǎng)鳳，中醫(yī)藥學(xué)報2003年，31(6)55-58)。例如，冰片本身對心血管及神經(jīng)系統(tǒng)的藥效如何、它是否僅僅通過提高其它藥物的生物利用度而發(fā)揮藥效、它具體的作用靶點在哪里、它的藥效和劑量之間的關(guān)系如何、它在臨床應(yīng)用有無時間效應(yīng)等，遺憾的是，現(xiàn)有技術(shù)對此并沒有清楚、合理的解釋。
在這種情況下，當(dāng)人們試圖采用多種天然藥物聯(lián)用的方式，以期通過它們之間的加合、甚至協(xié)同作用來減少用藥量，從而在確保(甚至提高)療效的同時進(jìn)一步降低不良反應(yīng)時，卻在現(xiàn)有技術(shù)中找不到可靠的科學(xué)依據(jù)。眾所周知，天然藥物的成分、作用機(jī)理十分復(fù)雜，與化學(xué)藥品之間的相互作用相比，更難以預(yù)測其相互作用。
因此，本領(lǐng)域?qū)斜陌踩行У奶烊凰幬?組合)有著迫切的需求。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明人在這方面進(jìn)行了深入的探索，并取得了諸多喜人的結(jié)果。
本發(fā)明的一個目的在于提供冰片與其它活性成分的組合，用于治療和/或預(yù)防心腦血管等疾病。
通過大量先導(dǎo)性試驗，我們初步確定以冰片和芍藥為基礎(chǔ)的藥物具有這樣的潛質(zhì)。當(dāng)試圖從現(xiàn)有技術(shù)中探尋這種結(jié)合的依據(jù)時，我們發(fā)現(xiàn)針對冰片能否與芍藥聯(lián)合應(yīng)用，二者的作用機(jī)制是加合、協(xié)同還是拮抗等基礎(chǔ)問題，迄今為止的已有技術(shù)沒有提供科學(xué)依據(jù)。至于二者是否能再與其它活性成分聯(lián)合，已有技術(shù)沒有類似的暗示。
在傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)中，對毛茛科植物芍藥的臨床應(yīng)用極其廣泛，例如在《傷寒淪》全書112方中用芍藥者計33首，約占總方數(shù)的三分之一(李中南，安徽中醫(yī)學(xué)院學(xué)報1992年，11(2)52-53)?，F(xiàn)代植物化學(xué)認(rèn)為，赤芍、白芍化學(xué)成分基本一致，其中的芍藥總苷是主要活性成分，具有廣泛的藥理活性，對心血管疾病、老年癡呆、糖尿病、炎癥、腫瘤、肝病等有一定的療效(傅立海，安徽醫(yī)藥2002年，6(2)62-63；阮金蘭，中國藥理學(xué)報2003年，19(9)695-670)。
已進(jìn)行的研究表明，芍藥與冰片的組合可以明顯增強(qiáng)冰片固有的藥理作用，比如抗腦缺血再灌注損傷作用、抗炎性反應(yīng)作用等。令人驚奇的是，二者的組合還降低了冰片的毒性，這對于進(jìn)一步促進(jìn)冰片的廣泛應(yīng)用具有現(xiàn)實意義。
因此，本發(fā)明的一個目的在于提供具有協(xié)同增效和/或減毒作用的“冰片+芍藥”組合。
在本發(fā)明藥物組合物中，可以選擇藥味(例如芍藥)直接粉碎成粉入藥，也可以相當(dāng)于上述天然藥物材生藥量的提取物或其它形式入藥。因此，本發(fā)明藥物組合物的活性組分包括藥材原粉、脂或水溶性提取物(或有效部位)、或有效成分、或單體，或者采用現(xiàn)有技術(shù)中已有的其它制品形式。例如，所述活性組分包括a.冰片是指龍腦香樹脂的加工品或菊科植物艾納香葉提取的結(jié)晶，或以樟腦、松節(jié)油等為原料，經(jīng)化學(xué)方法合成的精制品。包括龍腦冰片(右旋龍腦)、艾片(左旋龍腦)、合成冰片(含有龍腦及異龍腦)。
b.芍藥是指芍藥(白芍、赤芍、川赤芍)的干燥根粉末，含有芍藥總苷類化合物(優(yōu)選為芍藥苷和芍藥內(nèi)酯苷)的提取物，或芍藥苷單體。另外，研究表明，同時含有芍藥苷、芍藥內(nèi)酯苷、羥基芍藥苷、氧化芍藥苷、苯甲酰芍藥苷、芍藥新苷、丹皮酚、丹皮酚原苷、丹皮酚苷、芍藥苷元等的有效部位也是有益的。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解的是，本發(fā)明芍藥苷類的來源并不局限于芍藥，含有芍藥苷類的其它植物(例如牡丹皮)也可實現(xiàn)本發(fā)明，其提取和制備方法為已知技術(shù)，在此不作贅述。
在上述組合中，冰片的含量不低于1wt％。
接著，基于上述成果，我們對“冰片+芍藥”與其他活性成分組合的可能性進(jìn)行了研究。根據(jù)現(xiàn)有技術(shù)中對冰片的認(rèn)識，我們推測血清中的藥物不一定均能透過體內(nèi)的各種屏障，而冰片的加入促進(jìn)了其他活性組分通透血腦屏障，即冰片有可能通過以“藥引”的方式增加了其它藥物的療效。
初步的試驗表明，除上述兩種活性組分a和b之外，本發(fā)明組合物可以包含其它活性成分，只要其不與所述適應(yīng)癥沖突、且不對“冰片+芍藥”組合的協(xié)同增效和/或減毒作用產(chǎn)生不利影響即可。經(jīng)過大量的篩選工作，選自下述c1-c7的活性組分滿足上述要求。
在隨后進(jìn)行的試驗中，發(fā)現(xiàn)了十分有趣的現(xiàn)象“芍藥+組分c”或者“冰片+組分c”的組合，均不具有本發(fā)明“冰片+芍藥+組分c”組合的效果。這表明，本發(fā)明之有益效果并非僅僅來源于冰片，而是來源于“冰片+芍藥”這一基礎(chǔ)組合。這一發(fā)現(xiàn)，對于理解本發(fā)明之出人意料效果是有利的。業(yè)已進(jìn)行的實驗表明，在偏離這一組方條件的情況下，即單獨的芍藥或單獨的冰片分別與組分c組合時，則不具備本發(fā)明之協(xié)同治療/預(yù)防效果和/或減毒作用。
因此，本發(fā)明的另一個目的在于提供具有協(xié)同增效和/或減毒作用的“冰片+芍藥+組分c”組合。
其中，所述活性組分c選自以下c1-c7中的一種或兩種
c1.丹參是指主要含有丹酚酸*和/或丹參酮*的丹參提取物；或丹參水溶性提取物，主要含有以丹酚酸A、丹酚酸B、原兒茶醛、丹參素為代表的酚酸類成分(總酚酸含量40％、優(yōu)選60％以上)，或丹參酚酸單體或其藥用鹽(例如鎂鹽)，或丹參酚酸單體的混合物；或丹參脂溶性提取物，主要含有丹參酮(丹參酮含量50％、優(yōu)選80％以上，例如丹參酮I、丹參酮IIA、丹參酮IIB、隱丹參酮、二氫丹參酮I等)，或丹參酮單體或其藥用鹽(例如磺酸鈉鹽)，或丹參酮單體的混合物?；騝2.燈盞花是指燈盞花(又名燈盞細(xì)辛)的全草粉末、燈盞細(xì)辛的水提取物、燈盞細(xì)辛的低級醇提取物(含有野黃芩苷*(即燈盞乙素)、單/雙咖啡?？鼘幩?酯)*等的有效部位)、燈盞花素(含野黃芩苷、燈盞甲素及其它黃酮類成分)、或游離或鈉鹽形式的野黃芩苷單體。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解的是，本發(fā)明野黃芩苷的來源并不局限于燈盞花，含有野黃芩苷的其它植物(例如黃芩、半枝蓮等)也可實現(xiàn)本發(fā)明，同樣，單/雙咖啡?？鼘幩?酯)的來源也并不局限于燈盞花，比如咖啡豆，這些提取和制備方法為已知技術(shù)，在此不作贅述。或c3.紅花是指含有紅花總黃色素(例如紅花黃色素A*、B，含量50％以上)的紅花提取物，(羥基)紅花黃色素單體，或者這些單體的混合物。或c4.葛根是指含有大豆黃酮、大豆黃酮苷、葛根素*、二葡萄糖大豆苷、甲氧基葛根素、7-木糖-葛根素、二乙?；?葛根素、芒柄花素等多種異黃酮類的葛根提取物，或葛根總黃酮，或葛根素單體及其衍生物，或大豆黃酮、或大豆異黃酮單體，或者這些單體的混合物。或c5.銀查是指銀杏提取物(例如低級醇、丙酮、乙酸乙酯的銀杏葉提取物)，主要含有銀杏內(nèi)酯*和/或銀杏黃酮*作為活性成分的銀杏提取物(例如標(biāo)準(zhǔn)提取物Egb)，或銀杏黃酮單體和銀杏內(nèi)酯單體，或銀杏內(nèi)酯單體，或銀杏黃酮單體。其中，所述銀杏內(nèi)酯是指含有各種銀杏萜類內(nèi)酯物質(zhì)(二萜內(nèi)酯A、B、C、M、J，倍半內(nèi)酯等)的混合物；“銀杏內(nèi)酯單體”是指上述萜類內(nèi)酯中各種內(nèi)酯類物質(zhì)的單體和/或其衍生物、或其化學(xué)修飾物、類似物。所述銀杏黃酮是指含有各種銀杏黃酮物質(zhì)(銀杏黃酮及其苷、總黃酮醇及其苷、雙黃酮、兒茶素等)的混合物；“銀杏黃酮單體”是指上述黃酮中各種黃酮類物質(zhì)的單體和/或其衍生物、或其化學(xué)修飾物、類似物?；騝6.川芎是指含有川芎嗪*、川芎酚、阿魏酸*、揮發(fā)油等的川芎提取物，或川芎嗪單體或者川芎嗪衍生物(例如鹽酸川芎嗪)，或阿魏酸/鈉及其衍生物(例如阿魏酸川芎嗪)，或者這些單體的混合物?；騝7.人參是指主要含有人參總皂苷*的人參提取物，或人參皂苷單體；含有人參皂苷的其它植物(例如三七等)也可實現(xiàn)本發(fā)明。
在上下文中，本發(fā)明藥物組合物所涉及的術(shù)語“活性組分”具有上述定義。
至于組分c1-c7，鑒于現(xiàn)有技術(shù)已對含有上述組分的協(xié)同/增益組方進(jìn)行了大量的研究，因此在本發(fā)明冰片與芍藥有益組合的基礎(chǔ)上，可選擇c1-c7中的一種或兩種組分與冰片、芍藥組合。
例如，涉及芍藥與c1-c7之一有益組合的現(xiàn)有技術(shù)包括ZL200410037717X披露了芍藥與紅花的組合、ZL2003101173090披露了芍藥與葛根的組合、2003101107099披露了芍藥與人參的組合、ZL200410040776披露了芍藥與燈盞花的組合、ZL981107567披露了芍藥與銀杏葉和人參的組合、徐鳳芹(中國中西醫(yī)結(jié)合雜志2004年，24(4)331-335)披露了芍藥與川芎的組合、周鳴(中國中醫(yī)藥科技2004年，11(1)46)披露了芍藥與三七總皂苷的有益組合等。
例如，涉及c1-c7之間有益組合的現(xiàn)有技術(shù)包括ZL031046657披露了三七總皂苷與燈盞花素的組合、ZL2003101110655披露了銀杏與人參的組合、ZL018208754披露了丹參和三七與冰片的組合、ZLCN200310125148.X 021533121披露了丹參與紅花的組合、ZL20041002252披露了人參與三七的組合、ZL200410040458披露了紅花與燈盞細(xì)辛的組合、ZL2004100340508披露了銀杏與人參的組合、ZL2004100581025披露了人參總皂苷與紅花黃色素的組合、ZL2004100581010披露了丹參與人參的組合、ZL971118795披露了川芎與人參的組合、ZL021394172披露了葛根與銀杏的組合、ZL2005100049273披露了葛根與三七的組合。
從表面上看，上述c1-c7組分似乎是不同的，但是從化學(xué)構(gòu)成上來分析，這些植物中已知的主要藥理活性成分可歸類為具有“活血化瘀”作用的兩大類成分黃酮、酚酸。從現(xiàn)代醫(yī)學(xué)理論的角度而言，上述植物中的黃酮類成分基本都具有擴(kuò)張血管、改善組織缺血、抗氧化、改善血液流變學(xué)等藥理功效；而酚酸類則具有更多樣性的作用，如抗炎性反應(yīng)、內(nèi)皮細(xì)胞保護(hù)等藥理功效。例如，以燈盞細(xì)辛、葛根素、丹參、銀杏葉、三七皂苷、川芎嗪、或紅花入藥而得的成藥，在臨床上也均以冠心病、腦卒中、糖尿病和/或老年癡呆為主要適應(yīng)癥。這充分證明，這些植物提取物在藥理功效和主要活性成分的化學(xué)構(gòu)成上具高度的“相似性”，這應(yīng)為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知。同樣地，獲得上述提取物或單體也屬于常規(guī)技術(shù)。
在本發(fā)明藥物組合物中，各組分的含量為組分a，1-15，優(yōu)選2-10，更優(yōu)選5-10重量份；和組分b，以芍藥苷計，為5-85，優(yōu)選10-60，更優(yōu)選20-50重量份；和組分c，以標(biāo)有符號*的成分計，為15-200，優(yōu)選20-120，更優(yōu)選40-80重量份。
而且，當(dāng)c為c1-c7中兩種組分的組合時，上述數(shù)值為二者的總量。例如，當(dāng)c為“燈盞花+紅花”時，則以“紅花黃色素A+燈盞乙素”、或者“紅花黃色素A+單/雙咖啡酰奎寧酸或其酯”計，為15-200重量份。
另外，在上下文中，“芍藥+冰片+丹參5/1/15”或者“芍藥+冰片+丹參5∶1∶15”，表示這三種活性組分的重量配比為5∶1∶15。
下面的試驗將證實按照本發(fā)明描述的具有上述定義之“冰片”、“芍藥”與“組分c”的組合，具有本發(fā)明所述的有益效果。鑒于現(xiàn)有技術(shù)中業(yè)已存在著相當(dāng)成熟且有效的制備/提純上述定義組分的技術(shù)，在此不作重點描述。例如，可以采用現(xiàn)代提取和分離技術(shù)，以提高活性物質(zhì)的純度、盡量除去不需要的雜質(zhì)，例如中國專利申請ZL011103787、ZL021109737、ZL021332983、ZL031131263、ZL02156681X、ZL011301309、ZL2004100413049、ZL00120986、ZL2003101134541、ZL021179239、ZL02149694、ZL92108623、ZL00113019、ZL02153750X、ZL03117754、ZL03141616、JP2000247890A、GB2317613A、中成藥(2004年，26(10)855-6)等。
可針對上述組分的理化特性和體內(nèi)吸收特點，采用標(biāo)準(zhǔn)制劑技術(shù)，加入藥用輔料制成適宜口服或非腸道給藥劑型，類似技術(shù)也已相當(dāng)成熟有效，例如口崩片(ZL2003101133322、ZL200310123852、ZL03102405、ZL200410016510、ZL200410041256)、緩控制劑(ZL011333332、ZL011387106、ZL02116223、ZL200310110709、ZL01117620、ZL02109758、ZL02116795、ZL02129313、ZL02134118、ZL03100021、ZL03133897)、環(huán)糊精包合物(ZL01141436、ZL02108778、ZL200310125175)、固體分散物(ZL001194313)、注射劑(ZL001215329、ZL031399428、ZL031573150、ZL2003101241702、ZL021337241、ZL95104038、ZL97101107、ZL02155001、ZL021332983、ZL031279953、ZL03141614、ZL03113037、ZL2003101210259、ZL200410013845)、粉針(ZL200410037717、ZL031323820、ZL021446008、ZL200410002103、ZL03131959.9、ZL200410013937、ZL2003101210259、ZL200410000912)、滴丸(ZL200310107292、ZL03136485、ZL01133515、ZL03135325、ZL200310119222)、分散片(ZL03125462、ZL03112974、ZL02153445)、微或納米制劑(ZL021378630、ZL00119579)、磷脂制劑(ZL001278126、ZL031320627、ZL01139971、ZL03128337)等。
隨后進(jìn)行的研究表明，與已有的“大”處方組合(例如，ZL2003101060209、ZL02129269、ZL02123498、ZL001039695、ZL02149694、ZL98100232.3、ZL001327631、ZL011139919等)相比，在減少了一種或更多活性成分的情況下，本發(fā)明藥物組合物依然保持了相同、甚至就某些方面而言更為有利的藥理作用(例如避免了某些成分之不需要的藥理作用或不良反應(yīng))，多項指標(biāo)顯著優(yōu)于單獨施用的芍藥或組分c，這是本領(lǐng)域技術(shù)人員無法根據(jù)現(xiàn)有技術(shù)推測的。
本發(fā)明藥物組合物，由10-90wt.％的活性組分和90-10wt.％的藥用輔料組成，可用于治療昏迷、高熱、心腦血管疾病、老年癡呆癥、腦細(xì)胞保護(hù)、視網(wǎng)膜中央靜脈阻塞、高脂血癥、脂肪肝，以及用于治療和預(yù)防糖尿病及其并發(fā)癥、預(yù)防心腦血管疾病的復(fù)發(fā)。上述藥物組合物克服了已有藥物存在的作用單一、服藥量大等缺點，代表了天然藥物治療和預(yù)防上述疾病的新趨勢。
藥理藥效學(xué)試驗研究一.冰片與芍藥組合的基礎(chǔ)研究1.對動物L(fēng)D50的影響1.1藥品本發(fā)明藥物組合物A組(芍藥苷+天然冰片4∶1)；本發(fā)明藥物組合物B組(芍藥苷+合成冰片5∶1)；天然冰片組(取冰片結(jié)晶體研缽研細(xì)過140目篩，含量和純度為右旋龍腦含量97％)；以及合成冰片組。
1.2動物純種ICR小鼠，體重平均18-22g，雌雄各半。
1.3方法與結(jié)果LD50測定(預(yù)實驗)預(yù)實驗中天然冰片小鼠灌胃給藥LD50為4.486g/kg bw合成冰片小鼠灌胃給藥LD50為4.711g/kg bw。
將A、B、合成冰片與天然冰片各組的藥物用蒸餾水溶液稀釋至0.2g冰片/ml。根據(jù)預(yù)試驗結(jié)果確定劑距，兩種冰片(四組)均按照兩種冰片(天然和合成)分別取其2倍LD50為最高劑量，以1、1/2、1/4LD50為中劑量和1/8LD50為低劑量的原則，即，天然冰片組和A組的小鼠隨機(jī)各分為5組(I-V)，每組10只，劑量分別是8.972、4.486、2.243、1.1215、0.561g/kg bw，灌胃給藥；合成冰片組和B組的小鼠隨機(jī)各分為5組(I-V)，每組10只，劑量分別是9.422、4.711、2.3555、1.1778、0.5889g/kg bw，灌胃給藥。
用孫瑞元等編制的NDST新藥統(tǒng)計程序軟件，用Bliss法計算LD50，結(jié)果見表1。
結(jié)果表明，本發(fā)明組合物可升高冰片對小鼠的LD50，降低由于一定濃度的冰片對機(jī)體所致的毒性，合用組分別與單用冰片比較，☆P＜0.1。
表1不同給藥組的LD50

2.協(xié)同抗炎作用2.1對急性滲出性炎癥(二甲苯所致小鼠耳腫脹)的影響2.1.1材料本發(fā)明藥物組合物(芍藥提取物+冰片5∶1)，分為10、30、50mg/kg組；空白對照生理鹽水；陽性對照相當(dāng)于同樣用藥量的芍藥提取物；10％冰片組；阿司匹林0.2g/kg組。
2.1.2方法與結(jié)果ICR小鼠，體重19-21g，按體重隨機(jī)均分組，每組10只，連續(xù)灌胃給藥4天(0.4ml/20g)，空白對照組給相同體積的蒸餾水。于末次給藥1h后，將60μl二甲苯均勻涂于每鼠右耳兩面，40min后將小鼠頸椎脫臼處死，用直徑8mm鞏膜穿孔器取下左右耳片稱重，求出兩耳重量差、計算腫脹率，t檢驗比較組間差異，結(jié)果見表2a。
表2a對二甲苯所致小鼠耳腫脹的影響(X±SD，n＝10)

注腫脹率＝[(右耳重-左耳重)/左耳重]×100％；與空白對照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與芍藥組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01；與冰片比較，#P＜0.05。
2.2對二甲苯致小鼠皮膚毛細(xì)血管通透性的影響2.2.1材料本發(fā)明藥物組合物(芍藥提取物+冰片8∶1)，分為10、30、50mg/kg組；
陽性對照藥相當(dāng)于同樣藥量的芍藥提取物；10％冰片組；阿司匹林0.2g/kg組。
2.2.2方法與結(jié)果參照陳奇主編的《中藥藥理研究方法學(xué)》制作動物炎癥模型，結(jié)果見下表2b表2b對二甲苯所致小鼠皮膚毛細(xì)血管通透性的影響(X±SD)

與對照組比較*P＜0.05，**P＜0.01；與芍藥提取物比較，△P＜0.05，△△P＜0.01；與冰片比較，#P＜0.05，##P＜0.01。
結(jié)果表明本發(fā)明組合物對二甲苯所致小鼠耳腫脹和對二甲苯所致小鼠皮膚毛細(xì)血管通透性有明顯的抑制作用，能明顯抑制二甲苯所致小鼠耳腫脹，可減輕二甲苯致小鼠皮膚毛細(xì)血管通透性，具有抑制炎癥早期毛細(xì)血管通透性增高的作用，與對照組相比具有顯著性差異，與同等劑量的單組分提取物組相比，本發(fā)明高劑量組合物組也具有統(tǒng)計學(xué)差異(P＜0.05)高中劑量組與空白對照組比較P＜0.05-0.01，表明該藥有明顯抑制急性炎癥滲透的作用，二藥合用，效果明顯增強(qiáng)，顯示出顯著的協(xié)同作用。
還有實驗表明，本發(fā)明組合物在抑制蛋清所致大鼠足跎腫脹中也顯示了顯著的效果，而且效果明顯優(yōu)于芍藥提取物和10％冰片濃度組，提示冰片與芍藥的配伍可以促進(jìn)芍藥/冰片單味藥的抗炎作用，其二者配伍起到協(xié)同抗炎的作用。
3.對其他藥物活性成分吸收的影響3.1.提高藥物活性成分在體內(nèi)的血藥濃度3.1.1材料本發(fā)明藥物組合物芍藥苷+冰片+丹參酮5/1/5；空白對照組生理鹽水；陽性對照藥相當(dāng)于同樣用藥量的單組分的芍藥苷+丹參酮。
3.1.2方法與結(jié)果將大鼠分為單用芍藥苷+丹參酮組、本發(fā)明藥物組合物組，給藥后不同時間點用氣相色譜法測定丹參酮的血藥濃度，用NONLIN程序處理求出藥動學(xué)參數(shù)。
兩組比較Cmax為587和896ng/ml，p＜0.01，AUC為3647663885，p＜0.05，標(biāo)明冰片能促進(jìn)丹參酮的吸收，從而提高其血藥濃度；同樣的方法(氣相色譜法)，測定芍藥苷的血藥濃度，也證明了冰片可促進(jìn)芍藥苷的吸收。
3.2.提高藥物活性成分的體內(nèi)生物利用度3.2.1材料本發(fā)明藥物組合物芍藥苷+冰片+丹參酮10/1/5；空白對照組生理鹽水；陽性對照藥相當(dāng)于同樣用藥量的單組分的芍藥苷+丹參酮。
3.2.2方法與結(jié)果將大鼠分為單用芍藥+丹參提取物組、本發(fā)明藥物組合物組。灌胃后，采用高效液相色譜法測定大鼠體內(nèi)的經(jīng)時過程并計算藥代動力學(xué)參數(shù)。本發(fā)明組合物組和提取物組的T1/2kα分別為17.35min和21.96min，T1/2ke分別為557.41min和429.64min，Tmax分別為17.35min和21.96min，Tmax為93.12min和101.56min，Cmax為12.68和8.67ng/ml，AUC(藥時曲線)為11876.46微克·min/ml和6385.11微克·min/ml。
實驗結(jié)果標(biāo)明，由于冰片的加入，明顯提高了芍藥和丹參有效成分的血藥濃度，顯著增加藥時曲線下面積，分析這是由于冰片促進(jìn)了芍藥和丹參有效成分(芍藥苷和丹參酮)在小腸的吸收，顯著提高了芍藥和丹參有效成分在大鼠體內(nèi)的生物利用度。
另外，對芍藥+冰片+燈盞細(xì)辛、芍藥+冰片+葛根、芍藥+冰片+燈盞細(xì)辛+紅花，也進(jìn)行了同樣的實驗，結(jié)果趨勢與上述藥物組合物的結(jié)果一致。
二.心腦血管方面的藥理作用1.對不同誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)血小板凝集的影響1.1材料本發(fā)明藥物組合物(芍藥苷+冰片+燈盞乙素6/1/10，簡稱組合物A，8mg/kg注射)，和芍藥提取物+冰片+燈盞花提取物(10/1/20，簡稱組合物B，20、30、60mg/kg灌胃)；空白對照組生理鹽水；陽性對照藥阿司匹林片(100mg/kg)；芍藥+燈盞(1∶1)組60mg/kg；芍藥+燈盞(1∶1)組；以及阿司匹林。
1.2方法與結(jié)果豚鼠分組，灌胃5天，空白對照用生理鹽水。末次給藥1小時后頸動脈采血，以枸櫞酸鈉抗凝，混勻，離心，合并上清液作為PRP(富血小板血漿)，血小板計數(shù)；余下血漿離心，取上清液作為PPP(貧血小板血漿)；以PPP調(diào)零，取PRP300μL加入比濁管，37℃溫育，加入誘導(dǎo)劑PAF(血小板活化因子)，聚集不同時間，記錄數(shù)據(jù)。結(jié)果見表3。
表3對血小板活化因子誘導(dǎo)的豚鼠血小板聚集的影響

與空白對照組比較*p＜0.05**p＜0.01；與燈盞+芍藥比較，#P＜0.05。
誘導(dǎo)劑為腺苷二磷酸(ADP)的實驗結(jié)果，類似于上表顯示的效果。
由上述結(jié)果可知，阿司匹林片、組合物A組、組合物高/中劑量B組均能抑制不同誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)的血小板聚集(凝集)、降低最大聚集率，其中以阿司匹林片、組合物A組、B組高劑量效果最好，中劑量組也表現(xiàn)出抑制血小板聚集作用，優(yōu)于芍藥+燈盞組，說明冰片起到了增加療效的作用；組合物A組也優(yōu)于阿司匹林組。
阿司匹林片、組合物A組、高劑量B組較對照組有顯著性差異(P＜0.01)，與單獨施用的芍藥提取物和丹參提取物組間比較，有顯著性差異(P＜0.05)。
1.3討論預(yù)防短暫性腦缺血發(fā)作就是為了推遲或防止腦梗死的發(fā)生，治療措施首選抗血小板聚集劑。阿司匹林是常用藥，但阿司匹林被證實抗血小板聚集的作用機(jī)制單一，僅阻斷TXA2合成這一途徑。另外，阿司匹林在治療該方面出現(xiàn)消化道反應(yīng)、出血等副作用，致使依從性差，這就導(dǎo)致部分病人在服用阿司匹林預(yù)防心腦卒中時的失敗。同時，阿司匹林對動脈硬化的預(yù)防療效不穩(wěn)定，其原因也在于該藥不能抑制兩種以上致聚劑誘導(dǎo)的血小板聚集，即不能抑制血小板發(fā)生聚集的全部途徑，而本發(fā)明組合物則可提高cAMP含量和抑制不同誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)血小板凝集，臨床也驗證本發(fā)明的組合物在抑制血小板聚集的作用方面效果等同或者優(yōu)于阿司匹林，且沒有阿司匹林的副作用(臨床治療階段，阿司匹林組的病人因強(qiáng)烈的副作用有近半數(shù)中途退出)。兩組副作用經(jīng)統(tǒng)計學(xué)處理，結(jié)果比較具有顯著性差異(P＜0.05)。
還對大鼠頸動-靜脈血流旁路術(shù)血栓形成的影響、對大鼠體外血栓形成的影響等進(jìn)行了實驗，結(jié)果表明本發(fā)明組合物對體內(nèi)血栓形成具有明顯對抗作用。
2.對防止血管成形術(shù)后再狹窄血管成形術(shù)后再狹窄(RS)，其發(fā)病率高達(dá)30-50％，其病例經(jīng)證實屬于血瘀證范疇，由于血管平滑肌細(xì)胞(VSMCs)的異常增殖，是RS的中藥病理特征，因此抑制VSMCs異常增殖成為世界性心血管研究預(yù)防RS的重要手段。
2.1材料本發(fā)明藥物組合物(芍藥苷+燈盞花素+冰片8/15/1，4、8mg/kg注射)；空白對照組生理鹽水；陽性對照藥芍藥苷注射液、燈盞花素注射液各8mg/kg；芍藥+燈盞(1∶3)注射液；2.2方法血管平滑肌細(xì)胞分離、培養(yǎng)、鑒定，參照文獻(xiàn)(Piper HM編輯，Cell CultureTechinques in Heart and Vessel Research.Springer-VerlagGermany.1990280)。
待90％VSMCs匯合后，經(jīng)胰蛋白酶消化后種于培養(yǎng)碟內(nèi)，加10％FBS+SMWM過夜培養(yǎng)，使細(xì)胞貼壁，細(xì)胞匯合約80％，再換成無血清DMEM(含青霉素100U/ml，鏈霉素100μg/ml)繼續(xù)培養(yǎng)24h，使細(xì)胞生長同步，最后換成10％FBS+DMEM，并隨機(jī)加入藥物，各濃度用DMEM稀釋至10μl/孔。
3H-TdR摻入實驗置換每孔1ml的DMEM，加入1uCi的3H-TdR，用液體閃爍計數(shù)器(1900CA)測定各孔的CPM值。
細(xì)胞存活率＝貼壁細(xì)胞/總細(xì)胞數(shù)(貼壁細(xì)胞+不貼壁細(xì)胞)2.3結(jié)果表4對平滑肌細(xì)胞3H-TdR摻入量的影響(X±s)


與對照比較，*p＜0.05**p＜0.01；與芍藥比較，△P＜0.05，△△P＜0.01；與燈盞比較，#P＜0.05；與芍藥+燈盞比較，◇p＜0.05，◇◇p＜0.01表5對平滑肌細(xì)胞計數(shù)的影響(X±s)

與空白對照比較，*p＜0.05，**p＜0.01；與芍藥比較，△P＜0.05，△△P＜0.01；與燈盞比較，#P＜0.05，##P＜0.01；與芍藥+燈盞比較，◇p＜0.05，◇◇p＜0.01。
本實驗用細(xì)胞計數(shù)法分析，各組藥物對細(xì)胞增殖的影響與對平滑肌細(xì)胞3H-TdR摻入基本一致，并且測得細(xì)胞存活率沒有明顯影響，均在90％以上。
2.4結(jié)論本發(fā)明藥物組合物、芍藥苷+燈盞注射液、燈盞注射液對血管平滑肌細(xì)胞(VSMCs)的異常增殖具有抑制作用。本發(fā)明藥物組合物最強(qiáng)，與芍藥苷+燈盞比較，組間具有顯著性差異，分析可能是芍藥苷和燈盞提取物(燈盞花素)以及冰片的作用機(jī)制不同而共同帶來的有益效果，組間顯著性差異(P＜0.05)。證明芍藥和燈盞以及冰片合用能增強(qiáng)芍藥和燈盞的活血化瘀功效，三者起到協(xié)同作用。
另外，對芍藥+冰片+燈盞細(xì)辛、芍藥+冰片+葛根、芍藥+冰片+燈盞細(xì)辛+葛根)，進(jìn)行了同樣的實驗，結(jié)果與上述藥物組合物的結(jié)果相近似，芍藥+冰片組的活血化瘀功效略遜于本發(fā)明的其它組合物組。
三.促醒作用1.材料小鼠昆明種，體重18-22g，雌雄各半。
試藥醒腦靜注射液(云南大理藥業(yè)有限公司，10ml/支)；燈盞花注射液(云南生物谷制藥廠)；燈盞+芍藥注射液(自制)；安鈉咖注射用原料(上海第十四制藥廠)；本發(fā)明組合物(芍藥+冰片+燈盞10/1/20)高中低劑量組；本發(fā)明組合物2(芍藥+冰片+燈盞+紅花4/1/2/3)組40mg/kg；本發(fā)明組合物3(芍藥+冰片+葛根4/1/5)組40mg/kg。
2.方法與結(jié)果小鼠隨機(jī)分組，分別尾靜脈注射氯化鈉注射液、安鈉咖生理鹽水溶液、醒腦靜注射液等試藥，每天一次，連續(xù)給藥2天，于末次給藥后15min，腹腔注射戊巴比妥鈉生理鹽水溶液(3mg/ml)0.3ml/20g，記錄小鼠翻正反射消失至恢復(fù)的時間，計算各組均值和標(biāo)準(zhǔn)差，進(jìn)行t檢驗，結(jié)果見表6。
表6對小鼠的促醒作用(X±SD，n＝10)

與空白對照組比較*P＜0.05，**P＜0.01；與燈盞組比較△P＜0.05，△△P＜0.01；與燈盞+芍藥比較，#P＜0.05，##P＜0.01。
3.結(jié)論與對照組相比，本發(fā)明組合物、對照藥醒腦靜、安鈉咖組均表現(xiàn)出促醒的作用。與燈盞+芍藥比較，本組合物呈現(xiàn)顯著性差異，表明芍藥燈盞與冰片的合用，增強(qiáng)了冰片(潛在的)促醒方面的藥理活性。
四.糖尿病方面的藥理作用1.降血糖作用1.1材料本發(fā)明藥物組合物芍藥提取物+冰片+燈盞花提取物+銀杏葉提取物20/1/30/10，A組為10mg/kg注射，B組為80mg/kg灌胃；
正常對照組生理鹽水；糖尿病組生理鹽水；陽性對照藥銀杏內(nèi)酯；野黃芩苷；冰片+燈盞+銀杏葉組合物；降糖靈片；1.2.方法與結(jié)果糖尿病實驗?zāi)Ｐ偷慕⒍塖D大鼠按照150mg/kg體重尾靜脈注射四氧嘧啶液，在四氧嘧啶液作用下，大鼠的胰島β細(xì)胞受到損傷，造成胰島素發(fā)生障礙，3天后尾靜脈采血測空腹血糖，血糖值大于11.0mmol/L的為糖尿病大鼠。
每日一次，連續(xù)4周，之后，尾靜脈采血測空腹血糖(FBG)和血清Ins。
表7對糖尿病大鼠的FBG和血清Ins的影響

與糖尿病組比較*p＜0.05**p＜0.01；與野黃芩苷/銀杏內(nèi)酯比較，△P＜0.05，△△P＜0.01；與冰片+燈盞+銀杏葉組合物比較，#P＜0.05，##P＜0.01。
上述實驗表明，以本發(fā)明藥物組合物注射組和口服組的效果最明顯。口服野黃芩苷/銀杏內(nèi)酯均可產(chǎn)生一定的降低血糖的作用，但不如冰片+燈盞+銀杏葉組合明顯，更不如本發(fā)明組合物(芍藥+冰片+燈盞+銀杏葉組合物)的效果明顯。降糖靈片只顯示降低血糖的效果。本發(fā)明組合物注射組明顯降低了四氧嘧啶糖尿病的血糖，并對血清Ins水平影響不明顯，這表明芍藥、冰片、燈盞和銀杏葉的聯(lián)合用藥對四氧嘧啶糖尿病大鼠產(chǎn)生了較強(qiáng)的降血糖作用，且降血糖作用不是通過提高胰島素水平實現(xiàn)的。
同時，本發(fā)明研究了本發(fā)明組合物對糖尿病模型的大鼠的血清、肝、腦中脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物丙二醛(MDA)的影響。與正常對照組相比，糖尿病模型的大鼠的血清、肝、腦、胰腺中脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物丙二醛(MDA)含量顯著提高，而施用經(jīng)過本發(fā)明藥物后，上述組織中的MDA明顯下降，說明銀杏(內(nèi)酯)和芍藥(苷)以及銀杏(內(nèi)酯)是改善和治療糖尿病的有效藥物，尤其以三者組合并輔助一定比例的冰片配伍使用，其伍用加合的效果最好(明顯優(yōu)于單用各組分)。
2.對糖尿病大鼠視網(wǎng)膜保護(hù)作用2.1材料與方法實驗動物選用雄性SD大鼠50只，適應(yīng)性飼養(yǎng)7天，測空腹血糖均低于7mmol/L，隨機(jī)分為正常對照組(E組)10只，實驗組40只。用鏈尿佐菌素(STZ)誘發(fā)糖尿病。凡血糖≥16.7mmol/L作為糖尿病組，再隨機(jī)分為3組，各10只，DM組為糖尿病未治療組，每天生理鹽水100mg/kg灌胃；A組為冰片+紅花提取物(5∶2)組，40mg/kg灌胃；B組為芍藥提取物+紅花提取物(1∶2)組，20mg/kg灌胃；C組為本發(fā)明組合物組∶冰片+芍藥提取物+紅花提取物(4∶1∶6)，40mg/kg灌胃。各組分2籠喂養(yǎng)，自由進(jìn)食和飲水。
2.2結(jié)果試驗表明，本發(fā)明組合物對于DM大鼠有促進(jìn)體重增加、降低血糖的作用，見表8。
與正常組比較各組糖尿病大鼠視網(wǎng)膜組織NOS的活性、AR(醛糖還原酶)的活性顯著增強(qiáng)，NO含量顯著增加。與DM組比較C組大鼠視網(wǎng)膜組織NOS的活性、AR的活性明顯被抑制，NO的含量也顯著減少，而A、B組的抑制作用不明顯，見表9。
2.3討論①高血糖水平和糖化血紅蛋白比例升高與視網(wǎng)膜病變發(fā)生、發(fā)展之間有密切的關(guān)系。上述實驗表明，本發(fā)明組合物降低血糖的作用，能明顯抑制AR和NOS的活性，減少NO的合成，對糖尿病視網(wǎng)膜病變有明顯防治作用。
同時發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明組合物能顯著降低NO含量，這可能與本發(fā)明組合物能提高糖尿病大鼠視網(wǎng)膜組織SOD的活性有關(guān)，SOD活性增強(qiáng)，及時清除過量生成的NO，對自由基損傷起一定保護(hù)作用。
②在另一項試驗中，考察了本發(fā)明組合物對糖尿病型小豬視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮生長因子表達(dá)的影響，研究表明本發(fā)明組合物有明顯的降血糖和減輕胰島素抵抗的作用。
③另外，國內(nèi)外學(xué)者認(rèn)為可通過抑制VEGF的表達(dá)來阻止和延遲增生性糖尿病視網(wǎng)膜病變(PDR)的形成。申請人已進(jìn)行的研究表明，與對照組(高脂高蔗糖飼料+冰片+紅花提取物或+芍藥提取物+紅花提取物)相比，治療組(高脂高蔗糖飼料+本發(fā)明組合物)的動物視網(wǎng)膜組織中的VEGF蛋白表達(dá)具有顯著性差異(P＜0.01)。
發(fā)明人希望借上述表述非限定性地解釋本發(fā)明組合物效果明顯優(yōu)于使用冰片+紅花提取物組合或芍藥+紅花提取物組合的機(jī)制。
表8各組大鼠體重和血糖比較(n＝10)

與E組比較*P＜0.01；與DM組比較#P＜0.01表9各組大鼠視網(wǎng)膜組織NO的含量、NOS的活性、AR的活性(n＝10)

與E組比較*P＜0.01；與DM組比較#P＜0.01五.對高血脂癥大鼠的抗氧化作用1.材料本發(fā)明藥物組合物芍藥+冰片+紅花4/1/5，50mg/kg灌胃；正常對照組生理鹽水；高血脂組生理鹽水；陽性對照藥紅花提取物50mg/kg(含有總紅花黃色素)；芍藥苷(50mg/kg)；VE(50mg/kg)；紅花提取物；紅花+冰片組。
2方法與結(jié)果高血脂模型的建立Wistar大鼠給予高脂飼料；正常對照組喂食普通飼料。與正常組比較高脂模型血清和肝臟的LPO明顯升高，而SOD活性明顯降低。
藥物灌胃，處理動物，測過LPO和SOD，按照試劑盒說明書操作，取1/2肝臟待測LPO和SOD，結(jié)果見表10表10對高血脂大鼠血清和肝臟LPO和SOD的影響(nmol/L)


與高血脂組比較*p＜0.05，**p＜0.01；與芍藥比較，△P＜0.05，△△P＜0.01；與紅花+冰片比較，#P＜0.05，##P＜0.01。
3結(jié)論實驗表明，本發(fā)明組合物的抗氧化活性顯著優(yōu)于單獨施用的芍藥、紅花以及紅花與冰片的組合。推測這是因為本發(fā)明組合物中含有芍藥苷、龍腦和總紅花黃色素，這三種化學(xué)成分可從不同方面、以不同機(jī)制抑制乳酸脫氫酶的釋放，具有顯著的抗氧化和抗活性氧的作用，具有一定的抗脂質(zhì)過氧化作用。
上述結(jié)果還證明紅花與冰片的組合雖然可以在一定程度上促進(jìn)抗氧化活性，但是同時含有芍藥和冰片，是組合物在抗氧化方面取得突出效果的必要條件。
本發(fā)明組合物的伍用則沒有發(fā)現(xiàn)毒副作用，因此采用芍藥和紅花與冰片伍用，既起到協(xié)同作用增加了療效，又沒有帶來的不良副作用。
另外，還從保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞、減少腦組織丙二醛(MDA)和NO生成等方面，考察了本發(fā)明組合物的抗氧化作用，結(jié)果證明本發(fā)明組合物對腦組織MDA有明顯的抑制作用，降低了腦組織中升高的NO，對神經(jīng)細(xì)胞也顯示了保護(hù)作用。
六.腦細(xì)胞保護(hù)作用1材料實驗動物健康Wistar大鼠72只，體重250±10g；藥物本發(fā)明組合物(冰片+芍藥苷+葛根素2/1/3，30mg/kg)；陽性對照藥芍藥組芍藥苷+葛根素注射，30mg/kg；冰片組冰片+葛根素注射，30mg/kg；依達(dá)拉奉組依達(dá)拉奉注射液注射，10mg/kg。
2.方法大鼠隨機(jī)分為6組，每組12只。正常對照組由左頸外靜脈插管，靜注1％肝素(2ml/kg)，分別于即刻及1.5h經(jīng)左頸外靜脈插管給0.9％氯化鈉液3ml/kg，3h后取腦檢測或固定。模型組參照Kaizumis栓線法建立腦缺血再灌注動物模型。實驗動物模型均缺血1.5h取腦檢測或固定，然后取出栓線再灌注1.5h，取腦檢測或固定。標(biāo)本將大鼠斷頭取腦，剝離腦組織，取視交叉和腳間窩兩個冠狀切面間分別取腦皮質(zhì)和尾殼核光、電鏡標(biāo)本。
腦水腫及腦鈣含量的測定取右前腦50-100mg，烘干至恒重，即為干重。
腦含水量測定用公式(濕重-干重)/濕重，計算腦含水量。
3.結(jié)果①大鼠腦組織梗塞區(qū)觀察光鏡下模型組神經(jīng)元輪廓模糊，胞體著色變深，胞核小、胞質(zhì)分界不清。細(xì)胞周圍亮區(qū)變寬與正常對照組有顯著差異(P＜0.01)。本發(fā)明組合物組及依達(dá)拉奉組神經(jīng)元結(jié)構(gòu)尚清晰，胞核與胞質(zhì)界限尚能分清，細(xì)胞周圍亮區(qū)較寬，與模型組相比雖有縮小，但無顯著性差異。芍藥苷組和冰片組神經(jīng)元結(jié)構(gòu)欠清晰，胞核與胞質(zhì)界限能分清，細(xì)胞周圍亮區(qū)較寬，與模型組相比未見明顯縮小。
電鏡下模型組神經(jīng)元變形，明暗神經(jīng)元不易區(qū)分，胞核變形，表面呈鋸齒狀，核內(nèi)異染色質(zhì)增多、核膜及核周隙模糊不清、核質(zhì)分界不清、網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)消失、細(xì)胞器減少或變形、結(jié)構(gòu)不清。線粒體呈氣球樣腫脹、質(zhì)膜結(jié)構(gòu)不清或消失斷裂、細(xì)胞周圍有大量水腫液呈低電子密度亮區(qū)。本發(fā)明組合物組及依達(dá)拉奉組神經(jīng)元核周核膜清晰、核內(nèi)異染色質(zhì)稍增多、核周間隙較狹窄、胞質(zhì)內(nèi)細(xì)胞器較明顯、但線粒體均有水腫樣改變、細(xì)胞周圍有少量水腫液。芍藥苷組和冰片組神經(jīng)元核周核膜欠清晰、核內(nèi)異染色質(zhì)稍明顯增多、核周間隙較狹窄、胞質(zhì)內(nèi)細(xì)胞器不明顯、線粒體有水腫樣改變。模型組星形膠質(zhì)細(xì)胞水腫、胞質(zhì)電子密度降低、細(xì)胞器減少、局部細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)不清。本發(fā)明組合物組及依達(dá)拉奉組星形膠質(zhì)細(xì)胞的水腫表現(xiàn)較模型組輕，細(xì)胞器與模型組相比明顯較多。芍藥苷組和冰片組星形膠質(zhì)細(xì)胞則與模型組基本相似。
②腦組織鈣、丙二醛、超氧化物歧化酶、腦水分含量的實驗結(jié)果模型組腦組織丙二醛含量、鈣含量、腦水分均較正常對照組明顯升高(P＜0.01)，而SOD活性則明顯低于正常對照組(P＜0.01)；本發(fā)明組合物能抑制灌注后腦組織丙二醛含量的升高和升高SOD活性(P＜0.01)，改善腦水含量(P＜0.01)，效果與依達(dá)拉奉相當(dāng)，明顯優(yōu)于冰片+葛根素組、芍藥苷+葛根素組。
5.3結(jié)論本發(fā)明組合物能顯著抑制腦缺血再灌注大鼠腦組織MDA含量的升高和提高SOD活性，改善腦水含量，并從超微結(jié)構(gòu)上證實對膜性結(jié)構(gòu)尚有一定保護(hù)作用。本發(fā)明組合物主要通過提高SOD活性，清除氧自由基，從而對腦細(xì)胞起保護(hù)作用，其作用與依達(dá)拉奉相當(dāng)，明顯優(yōu)于冰片+葛根組、芍藥苷+葛根素組。
七.其它方面的藥理作用1.治療大鼠脂肪肝的療效觀察1.1材料與方法藥物本發(fā)明組合物組(冰片+芍藥苷+人參皂苷1∶5∶3，40mg/kg、10mg/kg)；冰片組(冰片+人參皂苷20mg/kg)；芍藥苷組(芍藥苷+人參皂苷，20mg/kg)。
雄性SD大鼠50只，體重150g±10g。正常喂養(yǎng)1周后，隨機(jī)分為2組實驗組(40只)，飼以高脂高膽固醇飼料(10.0％豬油、2.0％膽固醇、0.5％膽酸鈉、87.5％基礎(chǔ)飼料)；和正常對照組(10只)，給予基礎(chǔ)飼料，兩組大鼠均自由進(jìn)水。
12周后，從實驗組隨機(jī)抽取8只，正常對照組隨機(jī)抽取2只，處死動物取肝臟做病理切片，驗證脂肪肝造模成功。將余下實驗組大鼠按體重層次再隨機(jī)分為組合物高劑量治療組、組合物低劑量治療組、冰片治療組及芍藥苷治療組。正常對照組以同等容積蒸餾水灌胃，各組均予基礎(chǔ)飼料飼養(yǎng)，給藥4周后取血及肝組織，檢測各項指標(biāo)。
1.2觀察指標(biāo)(1)實驗結(jié)束處死動物時，稱體重及肝重；(2)生物化學(xué)指標(biāo)測定空腹血糖(FBG)總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)和高密度脂蛋白-膽固醇(HDL-C)的含量、空腹血清胰島素(FINS)；(3)胰島素抵抗指數(shù)胰島素抵抗指數(shù)HOMA-IR＝(FBG×FINS)/22.5；和(4)組織病理學(xué)檢查分光光度法測定TG的含量。
1.3結(jié)果實驗進(jìn)行中各組均無動物死亡。
實驗結(jié)束時，冰片、芍藥苷治療組動物的體重、肝指數(shù)(肝濕重/體重×100％)比正常對照組顯著增高(P＜0.05；P＜0.01)；與冰片、芍藥苷治療組比較高、低劑量組合物治療組的體重、肝指數(shù)顯著降低(P＜0.01)；與正常對照組相比，高、低劑量組合物治療組體重、肝指數(shù)差異無統(tǒng)計學(xué)意義，見下表11。
血清和肝組織勻漿脂質(zhì)的變化冰片、芍藥苷治療組血清TG、TC及肝組織TG較正常對照組升高；與冰片、芍藥苷治療組比較高、低劑量組合物治療組中上述指標(biāo)均明顯改善，見下表12。
FBG和FINS等變化冰片治療組FBG和FINS及HOMA-IR呈增高趨勢；芍藥苷治療組FBG和FINS及HOMA-IR呈下降趨勢；與冰片治療組比較高、低劑量組合物治療組的FINS及HOMA-IR顯著下降，其余比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義，見下表12。
病理學(xué)改變(1)肉眼觀察冰片、芍藥治療組大鼠肝外觀呈奶油黃，體積明顯增大，邊緣變鈍，質(zhì)地變軟，切面略帶油膩感；高、低劑量組合物治療組肝外觀接近正常對照組；和(2)光鏡觀察冰片、芍藥苷治療組肝小葉中心帶肝細(xì)胞中出現(xiàn)大小不等的脂肪滴，部分肝細(xì)胞核則被脂肪滴擠壓而明顯偏位，小葉內(nèi)及匯管區(qū)局灶性炎性細(xì)胞浸潤，伴有一定程度的點片狀壞死；高、低劑量組合物治療組肝小葉和肝血竇結(jié)構(gòu)清晰，細(xì)胞內(nèi)見少許小泡性脂肪滴，偶見肝細(xì)胞壞死。
1.4結(jié)論上述實驗提示，本發(fā)明組合物可以顯著改善脂肪肝病變程度，改善脂肪代謝，顯著優(yōu)于冰片+人參皂苷、芍藥苷+人參皂苷。
由于非酒精性脂肪肝的發(fā)生與胰島素抵抗密切相關(guān)，且患者常合并肥胖、高血糖、高胰島素血癥。我們認(rèn)為本發(fā)明組合物是通過降低患者胰島素抵抗，改善脂代謝，抗細(xì)胞炎性等方面產(chǎn)生改善脂肪肝病變的作用，其協(xié)同作用機(jī)制值得進(jìn)一步探討。
表11 大鼠體重、肝指數(shù)的變化(X±S，n＝8)

與正常對照組比較*P＜0.05；#P＜0.01；與正常對照組比較□P＞0.05；與冰片、芍藥治療組比較▲P＜0.01表12 大鼠血清及肝勻漿脂質(zhì)的變化(X±S)

與正常對照組比較*p＜0.05；#p＜0.01；與模型對照組比較□P＞0.05；與丹參、芍藥治療組比較▲p＜0.05
表13大鼠空腹血糖、血清胰島素及胰島素抵抗指數(shù)水平的變化(X±S)

與冰片治療組比較*p＜0.052.治療兔視網(wǎng)膜靜脈阻塞的實驗研究2.1材料和方法純種雄性新西蘭白兔36只，體重2.2-2.5kg，造成視網(wǎng)膜靜脈阻塞模型。
分6組，每組6只，即空白對照組、本發(fā)明組合物治療組(冰片+芍藥苷+川芎嗪2/2/10，分高、中、低三個劑量組)、冰片治療組(冰片+川芎嗪)、芍藥苷治療組(芍藥苷+川芎嗪)。造模后第3天開始連續(xù)給藥10天，空白對照組給予等容量飲用水。
2.2結(jié)果眼底情況造模第2天可見眼底出血，第6天本發(fā)明組合物高劑量組眼底出血明顯開始吸收，而空白對照組眼底出血20天后才明顯開始吸收，差別有顯著性差異。冰片治療組和芍藥苷治療組分別與第11、18天開始眼底出血明顯開始吸收，這與空白對照組相比無顯著性差異。血液完全吸收后，空白對照組與芍藥苷治療組的眼底血管細(xì)而迂曲，而本發(fā)明組合物3個劑量組的眼底血管均接近正常情況，冰片治療組的眼底血管改變介于空白對照組和本發(fā)明組合物低劑量組之間。結(jié)果見表14。
眼底照相及熒光素眼底血管造影檢查本發(fā)明組合物3個劑量組、冰片治療組眼底血管形態(tài)接近正常，未見熒光素滲漏，亦未見新生血管，而空白對照組、芍藥苷組雖然眼底出血已經(jīng)吸收，但仍可見熒光素滲漏，并可見新生血管。眼底照相見6個組出血均已完全吸收，但血管形態(tài)不同，情況與直接檢眼鏡的檢查一致。
2.3結(jié)論實驗表明，本發(fā)明組合物對兔實驗性視網(wǎng)膜中央靜脈阻塞有非常顯著的治療作用。尤其值得注意的是，施用的冰片+川芎嗪或芍藥苷+川芎嗪均無法達(dá)到本發(fā)明組合物的治療效果。我們認(rèn)為，這與組合物中冰片和芍藥苷+川芎嗪在下述作用機(jī)制中產(chǎn)生明顯協(xié)同作用有關(guān)促進(jìn)藥物吸收、增強(qiáng)藥效、擴(kuò)張血管，減少血管阻力；改善微循環(huán)，提高耐缺氧能力；抑制纖維蛋白合成，抗凝血和組織增生；抑制過敏介質(zhì)的釋放，抗過敏反應(yīng)。
表14對兔眼底出血完全吸收時間的影響(x±s，n＝6)

與生理鹽水組比較*P＜0.05，**P＜0.01臨床觀察心腦血管疾病方面的臨床試驗1 藥物本發(fā)明組合冰片+燈盞花素，150mg/天；與芍藥提取物，15mg/天，合并口服。
對照燈盞花素120mg/天、芍藥芍藥提取物(含芍藥苷)15mg/天，口服。
2 方法與結(jié)果采用隨機(jī)雙盲對照的方法考察其療效和不良反應(yīng)，共觀察冠心病病人200例，其中治療組100例(口服本發(fā)明組合)，療效愈顯率43.87％，總有效率90.33％；對照組100例，愈顯率24.46％，總有效率73.23％，兩組冠心病療效經(jīng)統(tǒng)計學(xué)處理，P＜0.01，有統(tǒng)計學(xué)差異，治療組優(yōu)于對照組。治療組未見明顯的不良反應(yīng)。
采用隨機(jī)雙盲對照的方法考察其療效和不良反應(yīng)，共觀察急性缺血性病人150例，其中治療組80例，療效愈顯率38.34％，總有效率86.653％；對照組70例，愈顯率26.46％，總有效率74.93％。兩組冠心病療效經(jīng)統(tǒng)計學(xué)處理，P＜0.05，有統(tǒng)計學(xué)差異，治療組優(yōu)于對照組。治療組未見明顯的不良反應(yīng)。
制劑實施例實施例1 片劑取赤芍，粉碎成粗粉，加80-90％乙醇回流提取三次，合并提取液，減壓濃縮后用正丁醇提取三次，每次600ml，合并正丁醇提取液，減壓濃縮至無正丁醇味，加水400ml，加熱溶解，濾過，濾液噴霧干燥，得提取物I備用；天然冰片0.5g粉碎成細(xì)粉，與6g提取物I混勻，加入輔料(總重的5％)低取代羥丙基纖維素、硬脂酸鎂、淀粉、微晶纖維素，按照標(biāo)準(zhǔn)制粒和壓片工藝制備。
實施例2 片劑取燈盞花粉碎成粗粉，加75％乙醇回流提取三次，第一、二次各2小時，第三次1小時，合并提取液，減壓濃縮，用正丁醇提取三次，每次300ml，合并正丁醇提取液，減壓濃縮至無正丁醇味，加水加熱溶解，再加稀氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH值至7，濾過，濾液噴霧干燥，得提取物II備用；天然冰片2g粉碎成細(xì)粉，與10g提取物I、20g提取物II混勻，加入低取代羥丙基纖維素、硬脂酸鎂、淀粉、微晶纖維素，按照標(biāo)準(zhǔn)制粒和壓片工藝制備1000粒。
實施例3 軟膠囊劑取芍藥苷8g、冰片環(huán)糊精包合物25g(含冰片2.5g)、丹參的CO2超臨界萃取物15g(乙醇為夾帶劑)、鹽酸川芎嗪5g，與甘油混勻，制丸，即得軟膠囊劑。
實施例4 滴丸取赤芍，粉碎成粗粉后用水提取，將水提液上大孔吸附樹脂柱，用水、70％的乙醇洗脫，收集乙醇洗脫液，濃縮后濾去沉淀物，濾液噴霧干燥，得提取物III備用；取天然冰片3.5g粉碎成細(xì)粉，與15g提取物III、20g燈盞花素混勻，得IV；取木糖醇和紅藻膠混和均勻，加入上述方法制備的IV，充分混合，混合物加熱熔融，攪拌均勻并保溫，于約60℃下滴入0℃的甲基硅油中，制成1000粒滴丸，將滴丸瀝盡并擦盡冷卻液，待干燥后分裝。
實施例5 口腔崩解片取芍藥提取物10g、丹參提取物25g、冰片環(huán)糊精包合物25g(含冰片4g)、阿斯巴甜、檸檬香精、和硬脂酸鎂，混合過100目篩。加入交聯(lián)羧甲基纖維素鈉、微晶纖維素，混合均勻后過100目篩，壓片，共制成1000片。
實施例6 緩釋片劑取葛根總黃酮提取物12g、芍藥苷1g、、冰片環(huán)糊精包合物20g(含冰片3g)，均勻混合，加入乳糖、微晶纖維素、羥丙甲基基纖維素、聚乙烯吡咯、硬質(zhì)酸鎂，按照標(biāo)準(zhǔn)制粒和壓片工藝制備1000片。
實施例7 凍干針劑取燈盞乙素25g、適量有機(jī)堿，加注射用水約至900ml，攪拌使溶解，調(diào)節(jié)pH值后，加入芍藥苷15g至溶解，混合均勻，過濾，得V備用；取羥丙基-β-環(huán)糊精，加水使溶解，于攪拌器上攪拌，60℃保溫備用；將冰片溶液緩慢滴加至環(huán)糊精水溶液中，70℃攪拌2-3小時，室溫下繼續(xù)攪拌3-5小時(或超聲)以充分包合，濾過得到冰片HP-β-CD包合物VI(含冰片2g)；將V和VI混合，加凍干賦形甘露醇，加注射用水至全量，調(diào)pH值，加入活性炭，粗濾脫炭，所得濾液繼續(xù)用0.22μm微孔濾膜過濾，分裝，冷凍干燥。
權(quán)利要求
1.一種藥物組合物，由10-90wt.％的活性組分和90-10wt.％的藥用輔料組成，所述活性組分為組分a.冰片，1-15重量份；和組分b.芍藥干燥根粉末，或含有芍藥苷、芍藥內(nèi)酯苷、羥基芍藥苷、氧化芍藥苷、苯甲酰芍藥苷、芍藥新苷的芍藥提取物，或芍藥苷單體，5-85重量份。
2.如權(quán)利要求1的藥物組合物，其中組分a為2-10重量份，和組分b為10-60重量份。
3.一種藥物組合物，由10-90wt.％的活性組分和90-10wt.％的藥用輔料組成，所述活性組分為組分a.冰片，1-15重量份；和組分b.芍藥干燥根粉末，或含有芍藥苷、芍藥內(nèi)酯苷、羥基芍藥苷、氧化芍藥苷、苯甲酰芍藥苷、芍藥新苷的芍藥提取物，或芍藥苷單體，為5-85重量份；和組分c.15-200重量份，其選自以下c1-c7c1.含有丹酚酸和/或丹參酮的丹參提取物；或含有丹酚酸、丹參素的丹參水溶性提取物；或丹參酚酸單體或其藥用鹽；或丹參酚酸單體的混合物；或含有丹參酮的丹參脂溶性提取物；或丹參酮單體或其藥用鹽，或丹參酮單體的混合物；c2.燈盞花全草粉末，或燈盞花的醇提取物，或燈盞花素，或游離或鈉鹽形式的野黃芩苷單體；c3.含有紅花總黃色素的紅花提取物，或紅花黃色素A、B單體，或者這些單體的混合物；c4.含有大豆黃酮、大豆黃酮苷、葛根素、二葡萄糖大豆苷、甲氧基葛根素、7-木糖-葛根素、二乙酰基-葛根素、芒柄花素的葛根的異黃酮類提取物，或葛根總黃酮，或葛根素單體及其衍生物、或者這些單體的混合物；c5.銀杏提取物，或含有銀杏內(nèi)酯和/或銀杏黃酮作為活性成分的銀杏提取物，或銀杏黃酮單體和銀杏內(nèi)酯單體，或銀杏內(nèi)酯單體，或銀杏黃酮單體；c6.含有川芎嗪、川芎酚、阿魏酸、揮發(fā)油的川芎提取物，或川芎嗪單體及其衍生物，或阿魏酸/鈉及其衍生物，或者這些單體的混合物；c7.含有人參總皂苷的人參提取物，人參總皂苷，或人參皂苷單體。
4.如權(quán)利要求3的藥物組合物，所述活性組分為組分a.冰片，2-10重量份；和組分b.含有芍藥苷、芍藥內(nèi)酯苷的芍藥提取物，10-60重量份，和組分c.20-120重量份，其選自以下c1-c7c1.含有丹酚酸和/或丹參酮的丹參水溶性提取物；c2.含有野黃芩苷、單/雙咖啡?？鼘幩峄蚱漉サ臒舯K花醇提取物；c3.含有紅花總黃色素的紅花提取物；c4.含有葛根素的葛根提取物；c5.含有銀杏內(nèi)酯和/或銀杏黃酮作為活性成分的銀杏提取物；c6.含有川芎嗪、阿魏酸的川芎提取物；c7.含有人參總皂苷的人參提取物。
5.如權(quán)利要求3的藥物組合物，其中組分a為5-10重量份，組分b為20-50重量份，和組分c為40-80重量份。
6.如權(quán)利要求3-5之一的藥物組合物，其中所述活性組分為組分a.冰片；和組分b.芍藥苷單體；和組分c.選自以下c1-c7c1.含有丹參酮的丹參脂溶性提取物；c2.單/雙咖啡酰奎寧酸或其酯；c3.紅花黃色素A、B單體，或者這些單體的混合物；c4.葛根素單體及其衍生物，或者這些單體的混合物；c5.銀杏內(nèi)酯單體；c6.川芎嗪單體及其衍生物；c7.人參皂苷單體。
7.如權(quán)利要求3-5之一的藥物組合物，其中所述活性組分為組分a.冰片；和組分b.芍藥苷單體；和組分c.選自以下c1-c7c1.丹參酮單體或其藥用鹽，或丹參酮單體的混合物；c2.燈盞花素、野黃芩苷單體或其鈉鹽；c3.紅花黃色素A、B單體，或者這些單體的混合物；c4.葛根總黃酮；c5.銀杏黃酮單體；c6.川芎嗪單體及其衍生物和阿魏酸/鈉及其衍生物；c7.含有人參總皂苷的人參提取物。
8.如權(quán)利要求3-5之一的藥物組合物，其中所述活性組分為組分a.冰片；和組分b.含有芍藥苷、芍藥內(nèi)酯苷、羥基芍藥苷、氧化芍藥苷、苯甲酰芍藥苷、芍藥新苷的芍藥提取物，或芍藥苷單體；和組分c.選自以下c1-c5c1.含有丹酚酸、丹參素的丹參水溶性提取物；或丹參酚酸單體或其藥用鹽；或丹參酚酸單體的混合物；或含有丹參酮的丹參脂溶性提取物；或丹參酮單體或其藥用鹽，或丹參酮單體的混合物；c2.燈盞花素，或游離或鈉鹽形式的野黃芩苷單體；c3.含有紅花總黃色素的紅花提取物，或紅花黃色素A、B單體，或者這些單體的混合物；c4.含有大豆黃酮、大豆黃酮苷、葛根素、二葡萄糖大豆苷、甲氧基葛根素、7-木糖-葛根素、二乙?；?葛根素、芒柄花素的葛根的異黃酮類提取物，或葛根總黃酮，或葛根素單體及其衍生物、或者這些單體的混合物；c5.含有銀杏內(nèi)酯和/或銀杏黃酮作為活性成分的銀杏提取物，或銀杏黃酮單體和銀杏內(nèi)酯單體，或銀杏內(nèi)酯單體，或銀杏黃酮單體。
9.如權(quán)利要求3-5之一的藥物組合物，其中所述活性組分為組分a.冰片；和組分b.含有芍藥苷、芍藥內(nèi)酯苷的芍藥提取物，或芍藥苷單體；和組分c.選自以下c1、c2、c5c1.含有丹酚酸和/或丹參酮的丹參提取物；或含有丹酚酸、丹參素的丹參水溶性提取物；或丹參酚酸單體或其藥用鹽；或丹參酚酸單體的混合物；或含有丹參酮的丹參脂溶性提取物；或丹參酮單體或其藥用鹽，或丹參酮單體的混合物；或c2.燈盞花的醇提取物，或燈盞花素，或游離或鈉鹽形式的野黃芩苷單體；或c5.含有銀杏內(nèi)酯和/或銀杏黃酮作為活性成分的銀杏提取物，或銀杏黃酮單體和銀杏內(nèi)酯單體、或銀杏內(nèi)酯單體、或銀杏黃酮單體。
10.如權(quán)利要求3-5之一的藥物組合物，其中所述活性組分為組分a.冰片；和組分b.含有芍藥苷、芍藥內(nèi)酯苷的芍藥提取物，或芍藥苷單體；和組分c.選自c2、c3c2.單/雙咖啡?？鼘幩峄蚱漉ィ驘舯K花素，或游離或鈉鹽形式的野黃芩苷單體；c3.含有紅花總黃色素的紅花提取物。
11.如權(quán)利要求3-5之一的藥物組合物，其中所述活性組分為組分a.冰片；和組分b.含有芍藥苷、芍藥內(nèi)酯苷的芍藥提取物，或芍藥苷單體；和組分c.選自c3、c4c3.含有紅花總黃色素的紅花提取物；c4.葛根總黃酮，或葛根素單體及其衍生物，或者這些單體的混合物。
12.如權(quán)利要求3-5之一的藥物組合物，其中所述活性組分為組分a.冰片；和組分b.含有芍藥苷、芍藥內(nèi)酯苷的芍藥提取物，或芍藥苷單體；和組分c.選自c2、c4c2.單/雙咖啡酰奎寧酸或其酯，或燈盞花素，或游離或鈉鹽形式的野黃芩苷單體；c4.葛根總黃酮，或葛根素單體及其衍生物，或者這些單體的混合物。
全文摘要
本發(fā)明涉及藥物組合物，具體地說，是根據(jù)現(xiàn)代醫(yī)學(xué)理論研制的含有天然植物提取物或單體的藥用組合物及其制備方法和應(yīng)用，所述藥物主要含有芍藥和冰片，用于治療昏迷、心腦血管疾病、糖尿病等疾病。
文檔編號A61P3/00GK1823922SQ20051013256
公開日2006年8月30日 申請日期2005年12月26日 優(yōu)先權(quán)日2005年12月26日
發(fā)明者林艷和 申請人:深圳市生物谷科技有限公司